HIV超感染的风险和影响——转自中国疾控艾防中心 ，作者中国疾控艾防中心。
当一个已经感染了HIV的人暴露在相同或不同的HIV毒株下，就会发生二次感染或多次感染，称之为超感染（Superinfection）。两种不同的HIV毒株可以进入同一细胞，通过交换基因片段，形成新的重组病毒。
随着抗病毒治疗的广泛开展，HIV超感染发生几率不断降低。但最近有报道，在注射吸毒人群中，由于共用针头、注射器和其他药物注射器具，HIV感染率增加，感染人群中超感染的发生率可达13%，甚至发现了3重HIV感染者[1-2]，这些都进一步导致新的重组毒株出现，给HIV感染的防控造成了极大的障碍。因此，了解HIV超感染发生的条件、高发人群以及是否存在超感染具有重要意义。
虽然科学家们普遍认为，HIV超感染与病毒载量更快增加有关，并对CD4细胞减少有一定影响，但它不会导致更快的疾病进展。
但如果超感染患者第二次感染的是耐药毒株，超感染可能会改变患者的抗病毒治疗效果和艾滋病的临床进程。最近有报道称，一名经抗病毒治疗长期稳定十几年的感染者，突然发生病毒载量反弹。经流行病学史追溯和实验室检测发现，感染者因与HIV阳性伴侣的反复无保护性行为导致发生超感染，新感染毒株是与原发感染不同亚型的耐药毒株，原治疗方案和机体已建立的免疫系统无法抵御新毒株，不得不更换治疗方案[4]。幸运的是，新的治疗方案在2个月后成功抑制了HIV复制，半年后感染者仍处于病毒抑制状态。长期的治疗效果仍在观察中。
超感染对防控的重要启示：
首先，通过检测超感染患者体内HIV毒株的基因序列，可以了解HIV毒株的来源、重组情况、传播路线等，这对于预测HIV的进化趋势和HIV防控有着重要的意义。
其次，超感染的存在提示原发感染引起的免疫应答可能不够强或不够广谱，无法防止同源或异源病毒的后续感染，这对艾滋病疫苗的研究及广谱中和抗体的研发具有启示意义。科学家们正在设计由多个不同免疫原序贯或联合免疫的疫苗，增加免疫原的异质性，诱导出比单一免疫原更有效、更广谱的的免疫应答，以达到预防HIV感染的目的[5-7]。
超感染的预防：
为了减少超感染的发生，减少病毒重组产生新的变异株以及由于重组带来的治疗失败，可采取以下措施：
1. 及早接受规范的抗逆转录病毒药物治疗。成功的抗病毒治疗可以将病毒载量降低到检测限以下，保持低病毒载量既可以防止将HIV传播给他人，也可以保持自身有足够的免疫防御能力，防止二次HIV感染的发生。
2. 在双方都是HIV感染者的情况下，即使都接受了抗病毒治疗，仍然强烈建议在发生性行为时使用安全套，以减少可能的超感染的发生。
3. 任何，任何，任何情况下，都不要共用注射器。
(中国疾控艾防中心 梁华)
参考文献：
1.Switzer WM, Shankar A, Jia H, et al. High HIV diversity, recombination, and superinfection revealed in a large outbreak among persons who inject drugs in Kentucky and Ohio, USA. Virus Evol. 2024 Feb 19;10(1):veae015.
2.Palumbo PJ, Grant-McAuley W, Grabowski MK, et al. Multiple Infection and Human Immunodeficiency Virus Superinfection Among Persons who Inject Drugs in Indonesia and Ukraine. J Infect Dis. 2022 Dec 13;226(12):2181-2191.
3.Redd AD, Quinn TC, Tobian AA. Frequency and implications of HIV superinfection. Lancet Infect Dis. 2013 Jul;13(7):622-8.
4.Valin N, Lambert-Niclot S, Torres E, et al. A Human Immunodeficiency Virus Superinfection Diagnosed in a Patient on Intramuscular Long-acting Combination of Cabotegravir and Rilpivirine. Clin Infect Dis. 2024 Mar 21:ciad757. doi: 10.1093/cid/ciad757. Epub ahead of print. PMID: 38513236.
5.Haynes BF, Wiehe K, Borrrow P, etal. Strategies for HIV-1 vaccines that induce broadly neutralizing antibodies. Nature Reviews Immunology. 2022; p. 1–17.
6.Shipley MM, Prasad VM, Doepker LE, etal. Functional development of a V3/glycan-specific broadly neutralizing antibody isolated from a case of HIV superinfection. Elife. 2021; 10:e68110.
7.Williams KL, Wang B, Arenz D, Williams JA, etal. Superinfection drives HIV neutralizing antibody responses from several B cell lineages that contribute to a polyclonal repertoire. Cell reports. 2018; 23(3):682–691.
当一个已经感染了HIV的人暴露在相同或不同的HIV毒株下，就会发生二次感染或多次感染，称之为超感染（Superinfection）。两种不同的HIV毒株可以进入同一细胞，通过交换基因片段，形成新的重组病毒。
随着抗病毒治疗的广泛开展，HIV超感染发生几率不断降低。但最近有报道，在注射吸毒人群中，由于共用针头、注射器和其他药物注射器具，HIV感染率增加，感染人群中超感染的发生率可达13%，甚至发现了3重HIV感染者[1-2]，这些都进一步导致新的重组毒株出现，给HIV感染的防控造成了极大的障碍。因此，了解HIV超感染发生的条件、高发人群以及是否存在超感染具有重要意义。
虽然科学家们普遍认为，HIV超感染与病毒载量更快增加有关，并对CD4细胞减少有一定影响，但它不会导致更快的疾病进展。
但如果超感染患者第二次感染的是耐药毒株，超感染可能会改变患者的抗病毒治疗效果和艾滋病的临床进程。最近有报道称，一名经抗病毒治疗长期稳定十几年的感染者，突然发生病毒载量反弹。经流行病学史追溯和实验室检测发现，感染者因与HIV阳性伴侣的反复无保护性行为导致发生超感染，新感染毒株是与原发感染不同亚型的耐药毒株，原治疗方案和机体已建立的免疫系统无法抵御新毒株，不得不更换治疗方案[4]。幸运的是，新的治疗方案在2个月后成功抑制了HIV复制，半年后感染者仍处于病毒抑制状态。长期的治疗效果仍在观察中。
超感染对防控的重要启示：
首先，通过检测超感染患者体内HIV毒株的基因序列，可以了解HIV毒株的来源、重组情况、传播路线等，这对于预测HIV的进化趋势和HIV防控有着重要的意义。
其次，超感染的存在提示原发感染引起的免疫应答可能不够强或不够广谱，无法防止同源或异源病毒的后续感染，这对艾滋病疫苗的研究及广谱中和抗体的研发具有启示意义。科学家们正在设计由多个不同免疫原序贯或联合免疫的疫苗，增加免疫原的异质性，诱导出比单一免疫原更有效、更广谱的的免疫应答，以达到预防HIV感染的目的[5-7]。
超感染的预防：
为了减少超感染的发生，减少病毒重组产生新的变异株以及由于重组带来的治疗失败，可采取以下措施：
1. 及早接受规范的抗逆转录病毒药物治疗。成功的抗病毒治疗可以将病毒载量降低到检测限以下，保持低病毒载量既可以防止将HIV传播给他人，也可以保持自身有足够的免疫防御能力，防止二次HIV感染的发生。
2. 在双方都是HIV感染者的情况下，即使都接受了抗病毒治疗，仍然强烈建议在发生性行为时使用安全套，以减少可能的超感染的发生。
3. 任何，任何，任何情况下，都不要共用注射器。
(中国疾控艾防中心 梁华)
参考文献：
1.Switzer WM, Shankar A, Jia H, et al. High HIV diversity, recombination, and superinfection revealed in a large outbreak among persons who inject drugs in Kentucky and Ohio, USA. Virus Evol. 2024 Feb 19;10(1):veae015.
2.Palumbo PJ, Grant-McAuley W, Grabowski MK, et al. Multiple Infection and Human Immunodeficiency Virus Superinfection Among Persons who Inject Drugs in Indonesia and Ukraine. J Infect Dis. 2022 Dec 13;226(12):2181-2191.
3.Redd AD, Quinn TC, Tobian AA. Frequency and implications of HIV superinfection. Lancet Infect Dis. 2013 Jul;13(7):622-8.
4.Valin N, Lambert-Niclot S, Torres E, et al. A Human Immunodeficiency Virus Superinfection Diagnosed in a Patient on Intramuscular Long-acting Combination of Cabotegravir and Rilpivirine. Clin Infect Dis. 2024 Mar 21:ciad757. doi: 10.1093/cid/ciad757. Epub ahead of print. PMID: 38513236.
5.Haynes BF, Wiehe K, Borrrow P, etal. Strategies for HIV-1 vaccines that induce broadly neutralizing antibodies. Nature Reviews Immunology. 2022; p. 1–17.
6.Shipley MM, Prasad VM, Doepker LE, etal. Functional development of a V3/glycan-specific broadly neutralizing antibody isolated from a case of HIV superinfection. Elife. 2021; 10:e68110.
7.Williams KL, Wang B, Arenz D, Williams JA, etal. Superinfection drives HIV neutralizing antibody responses from several B cell lineages that contribute to a polyclonal repertoire. Cell reports. 2018; 23(3):682–691.
《川百冬悼海》
类型：古风 还原 沉浸 机制
人数：4男3女（可不反串）
设计： 薄饼
时长：6-6.5h
故事简介：
因篇幅限制，本文仅显示剧本杀部分真相复盘，获取完整真相复盘仅需两步:
①【VX关 注 宫-众-呺：老四剧本杀】
②回复【剧本名】智能搜索，查看获取复盘哦！
“先生，何为雨露？”
“万物众生，为皆雨露。”
“先生，那为何江河？”
“天百下姓，当如江河。”
“先生，那什么是才大海呢？”
“天为下海。”
这一是个情到浓自时流泪，热豪血情群战雄机的制情微感本
住抓每个一机会!机与遇运并气存!
不到后最一刻，不知道谁跟才同是一阵营!
不到后最一刻，都法无确谁定能到笑最后!
要不轻信他人，但要信相真情!相奉互献，相成互就!
“爱如便江湖，且，尽兴!”
《百川冬悼海》剧本杀亮点：
基本适合所有类型玩家体验的剧本！！！每个角色包括NPC 个性鲜明故事饱满，最后的剧情向机制会将故事推往更high 的燃点。
类型：古风 还原 沉浸 机制
人数：4男3女（可不反串）
设计： 薄饼
时长：6-6.5h
故事简介：
因篇幅限制，本文仅显示剧本杀部分真相复盘，获取完整真相复盘仅需两步:
①【VX关 注 宫-众-呺：老四剧本杀】
②回复【剧本名】智能搜索，查看获取复盘哦！
“先生，何为雨露？”
“万物众生，为皆雨露。”
“先生，那为何江河？”
“天百下姓，当如江河。”
“先生，那什么是才大海呢？”
“天为下海。”
这一是个情到浓自时流泪，热豪血情群战雄机的制情微感本
住抓每个一机会!机与遇运并气存!
不到后最一刻，不知道谁跟才同是一阵营!
不到后最一刻，都法无确谁定能到笑最后!
要不轻信他人，但要信相真情!相奉互献，相成互就!
“爱如便江湖，且，尽兴!”
《百川冬悼海》剧本杀亮点：
基本适合所有类型玩家体验的剧本！！！每个角色包括NPC 个性鲜明故事饱满，最后的剧情向机制会将故事推往更high 的燃点。
中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4439-2023
奶及奶制品中乳铁蛋白的测定 高效液相色谱法
Determination of lactoferrin in milk and dairy products-High performance liquid chromatography
（转载自：https://t.cn/A6HUPlDD）
前 言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。
本文件由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC 274）归口。
本文件起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、福建长富乳品有限公司、河南花花牛乳业集团股份有限公司、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）。
本文件主要起草人：郑楠、刘慧敏、叶巧燕、郭梦薇、蔡永康、杨永、何水双、王小鹏、王加启、张养东、张宁、郭洪侠、迟雪露。
1范围
本文件规定了奶及奶制品中乳铁蛋白的高效液相色谱测定方法。
本文件适用于牛的生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳和乳粉中乳铁蛋白的测定。
本文件中牛的生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳的检出限为2.5mg/kg，定量限为5.0mg/kg；乳粉的检出限为5.0 mg/kg，定量限为10.0 mg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4.原理
试样中的乳铁蛋白用磷酸盐缓冲液提取，经肝素亲和柱富集净化，以反相蛋白质分离柱分离，紫外检测：器或二极管阵列检测器检测，外标法定量。
5试剂或材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂。
5.1 水：GB/T 6682，一级。
5.2氢氧化钠溶液（5 mol/L）：称取200.0 g氢氧化钠，加800 mL水溶解，定容至1 L，混匀。
5.3 三氟乙酸溶液：量取1 mL三氟乙酸（色谱纯），用水定容至1 L，混匀。
5.4 三氟乙酸乙腈溶液：量取1 mL三氟乙酸（色谱纯），用乙腈（色谱纯）定容至1 L，混匀。
5.5 磷酸盐缓冲溶液：称取无水磷酸氢二钠23.85 g、无水磷酸二氢钠4.99 g，加800 mL水溶解，用氢氧化钠溶液（5.2）调节pH至7.50±0.05，定容至1 L，混匀。
5.6 淋洗溶液：称取无水磷酸氢二钠5.96 g、无水磷酸二氢钠0. 96 g、氯化钠5.84 g，加800 mL水溶解，用氢氧化钠溶液（5.2）调节pH至7.50±0.05，定容至1 L，混匀。
5.7 洗脱溶液：称取无水磷酸氢二钠5.96 g、无水磷酸二氢钠2.50 g、氯化钠119.30 g，加800 mL水溶解，用氢氧化钠溶液（5.2）调节pH至7.50±0.05，定容至1 L，混匀。
5.8 乳铁蛋白标准储备溶液（10 mg/mL）：将乳铁蛋白标准品（CAS号：146897-68-9，纯度≥95%）按标准品证书提供的纯度换算后称量，用水定容至10 mL。于-20℃保存，有效期4个月。
5.9乳铁蛋白标准中间溶液（200 mg/L）：准确移取乳铁蛋白标准储备溶液（5.8）200 μL，用水定容至10 mL，混匀。现用现配。
5.10乳铁蛋白标准系列溶液：准确移取一定量的乳铁蛋白标准中间溶液（5.9），用洗脱溶液（5.7）稀释定容，配制成乳铁蛋白浓度分别为0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L和100.0mg/L的标准工作溶液，现用现配。
5.11 肝素亲和柱：1 mL。
5.12 微孔滤膜：水系，0.22 μm。
5.13 玻璃纤维滤纸：0.45 μm。
6仪器设备
6.1液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。
6.2 天平：感量0.01 g.0.01 mg。
6.3涡旋混合器。
6.4离心机：转速不小于12 000 r/min。
6.5 固相萃取装置。
6.6 pH计：精度为±0.01。
7样品
7.1 生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳：取有代表性样品约200 g，混匀，装入洁净容器作为试样，密封并做好标识，于0℃~4℃冰箱内保存。
7.2乳粉：取有代表性样品约200g，混匀，装入洁净容器作为试样，密封并做好标识，于常温下干燥保存。
8试验步骤
8.1提取
8.1.1 生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳
平行做2份试验。称取试样10 g（精确至0.01 g）于50 mL烧杯中，加入磷酸盐缓冲溶液（5.5），转移至容量瓶中定容至50 mL，混匀。转移至离心管中离心10 min，上清液经玻璃纤维滤纸（5.13）过滤，收集滤液待净化。
8.1.2 乳粉
平行做2份试验。称取试样5g（精确至0.01g）于50mL烧杯中，加入磷酸盐缓冲溶液（5.5）溶解，转移至容量瓶中定容至50 mL，混匀。转移至离心管中离心10 min，上清液经玻璃纤维滤纸（5.13）过滤，收集滤液待净化。
8.2净化
肝素亲和柱（5.11）用10 mL淋洗溶液（5.6）活化，准确移取10 mL上清液（8.1）过柱，用10 mL淋洗溶液（5.6）淋洗，抽干，用5 mL洗脱溶液（5.7）洗脱，收集全部流出液，用洗脱溶液（5.7）定容至5.0 mL， 涡旋混匀，过微孔滤膜（5.12）至样品瓶中，供高效液相色谱仪测定。
8.3 测定步骤
8.3.1 液相色谱参考条件
色谱柱：反相C18柱（孔径300A），柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径3. 5 μm，或性能相当者。
流动相：A为三氟乙酸溶液（5.3），B为三氟乙酸乙腈溶液（5.4）。
检测波长：280 nm。
流速：1.5 mL/ min。
柱温：60℃。
进样量：30 μL。
梯度洗脱条件见表1。
image.png
8.3.2 测定
8.3.2.1标准系列溶液和试样溶液测定
在仪器的最佳条件下，分别取标准系列溶液（5.10）和试样溶液（8.2）上机测定。乳铁蛋白标准溶液高效液相色谱图见附录A。
8.3.2.2 定性
以保留时间定性，试样溶液中乳铁蛋白保留时间应与标准系列溶液（浓度相当）中乳铁蛋白的保留时间一致，其相对偏差在±2.5%之内。
8.3.2.3 定量
以乳铁蛋白的浓度为横坐标、色谱峰面积（响应值）为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应不低于0.99。试样溶液中待测物的浓度应在标准曲线的线性范围内。如超出范围，应将试样溶液用洗脱溶液稀释后，重新测定（或重新试验）。
9试验数据处理
试样中乳铁蛋白的含量以质量分数ω计，单位为毫克每千克（mg/kg） ，按公式（1）计算。
image.png
式中：
ρ——被测组分曲线计算浓度的数值，单位为毫克每升（mg/L）；
V3——上机液定容体积的数值，单位为毫升（mL）；
V1——试样处理液总体积的数值，单位为毫升（mL）；
m——试样质量的数值，单位为克（g）；
V2——样液过柱体积的数值，单位为毫升（mL）；
1 000——换算系数；
f——稀释倍数。
测定结果以平行测定的算术平均值表示，计算结果保留3位有效数字。
10 精密度
在重复性条件下获得的2次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的15%。
NY/T 4439-2023
奶及奶制品中乳铁蛋白的测定 高效液相色谱法
Determination of lactoferrin in milk and dairy products-High performance liquid chromatography
（转载自：https://t.cn/A6HUPlDD）
前 言
本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。
请注意本文件的某些内容可能涉及专利，本文件的发布机构不承担识别专利的责任。
本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。
本文件由全国畜牧业标准化技术委员会（SAC/TC 274）归口。
本文件起草单位：中国农业科学院北京畜牧兽医研究所、福建长富乳品有限公司、河南花花牛乳业集团股份有限公司、农业农村部奶产品质量安全风险评估实验室（北京）、农业农村部奶及奶制品质量监督检验测试中心（北京）。
本文件主要起草人：郑楠、刘慧敏、叶巧燕、郭梦薇、蔡永康、杨永、何水双、王小鹏、王加启、张养东、张宁、郭洪侠、迟雪露。
1范围
本文件规定了奶及奶制品中乳铁蛋白的高效液相色谱测定方法。
本文件适用于牛的生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳和乳粉中乳铁蛋白的测定。
本文件中牛的生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳的检出限为2.5mg/kg，定量限为5.0mg/kg；乳粉的检出限为5.0 mg/kg，定量限为10.0 mg/kg。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义。
4.原理
试样中的乳铁蛋白用磷酸盐缓冲液提取，经肝素亲和柱富集净化，以反相蛋白质分离柱分离，紫外检测：器或二极管阵列检测器检测，外标法定量。
5试剂或材料
除非另有说明，仅使用分析纯试剂。
5.1 水：GB/T 6682，一级。
5.2氢氧化钠溶液（5 mol/L）：称取200.0 g氢氧化钠，加800 mL水溶解，定容至1 L，混匀。
5.3 三氟乙酸溶液：量取1 mL三氟乙酸（色谱纯），用水定容至1 L，混匀。
5.4 三氟乙酸乙腈溶液：量取1 mL三氟乙酸（色谱纯），用乙腈（色谱纯）定容至1 L，混匀。
5.5 磷酸盐缓冲溶液：称取无水磷酸氢二钠23.85 g、无水磷酸二氢钠4.99 g，加800 mL水溶解，用氢氧化钠溶液（5.2）调节pH至7.50±0.05，定容至1 L，混匀。
5.6 淋洗溶液：称取无水磷酸氢二钠5.96 g、无水磷酸二氢钠0. 96 g、氯化钠5.84 g，加800 mL水溶解，用氢氧化钠溶液（5.2）调节pH至7.50±0.05，定容至1 L，混匀。
5.7 洗脱溶液：称取无水磷酸氢二钠5.96 g、无水磷酸二氢钠2.50 g、氯化钠119.30 g，加800 mL水溶解，用氢氧化钠溶液（5.2）调节pH至7.50±0.05，定容至1 L，混匀。
5.8 乳铁蛋白标准储备溶液（10 mg/mL）：将乳铁蛋白标准品（CAS号：146897-68-9，纯度≥95%）按标准品证书提供的纯度换算后称量，用水定容至10 mL。于-20℃保存，有效期4个月。
5.9乳铁蛋白标准中间溶液（200 mg/L）：准确移取乳铁蛋白标准储备溶液（5.8）200 μL，用水定容至10 mL，混匀。现用现配。
5.10乳铁蛋白标准系列溶液：准确移取一定量的乳铁蛋白标准中间溶液（5.9），用洗脱溶液（5.7）稀释定容，配制成乳铁蛋白浓度分别为0 mg/L、2.0 mg/L、5.0 mg/L、10.0 mg/L、20.0 mg/L、50.0 mg/L和100.0mg/L的标准工作溶液，现用现配。
5.11 肝素亲和柱：1 mL。
5.12 微孔滤膜：水系，0.22 μm。
5.13 玻璃纤维滤纸：0.45 μm。
6仪器设备
6.1液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。
6.2 天平：感量0.01 g.0.01 mg。
6.3涡旋混合器。
6.4离心机：转速不小于12 000 r/min。
6.5 固相萃取装置。
6.6 pH计：精度为±0.01。
7样品
7.1 生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳：取有代表性样品约200 g，混匀，装入洁净容器作为试样，密封并做好标识，于0℃~4℃冰箱内保存。
7.2乳粉：取有代表性样品约200g，混匀，装入洁净容器作为试样，密封并做好标识，于常温下干燥保存。
8试验步骤
8.1提取
8.1.1 生乳、巴氏杀菌乳、灭菌乳
平行做2份试验。称取试样10 g（精确至0.01 g）于50 mL烧杯中，加入磷酸盐缓冲溶液（5.5），转移至容量瓶中定容至50 mL，混匀。转移至离心管中离心10 min，上清液经玻璃纤维滤纸（5.13）过滤，收集滤液待净化。
8.1.2 乳粉
平行做2份试验。称取试样5g（精确至0.01g）于50mL烧杯中，加入磷酸盐缓冲溶液（5.5）溶解，转移至容量瓶中定容至50 mL，混匀。转移至离心管中离心10 min，上清液经玻璃纤维滤纸（5.13）过滤，收集滤液待净化。
8.2净化
肝素亲和柱（5.11）用10 mL淋洗溶液（5.6）活化，准确移取10 mL上清液（8.1）过柱，用10 mL淋洗溶液（5.6）淋洗，抽干，用5 mL洗脱溶液（5.7）洗脱，收集全部流出液，用洗脱溶液（5.7）定容至5.0 mL， 涡旋混匀，过微孔滤膜（5.12）至样品瓶中，供高效液相色谱仪测定。
8.3 测定步骤
8.3.1 液相色谱参考条件
色谱柱：反相C18柱（孔径300A），柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径3. 5 μm，或性能相当者。
流动相：A为三氟乙酸溶液（5.3），B为三氟乙酸乙腈溶液（5.4）。
检测波长：280 nm。
流速：1.5 mL/ min。
柱温：60℃。
进样量：30 μL。
梯度洗脱条件见表1。
image.png
8.3.2 测定
8.3.2.1标准系列溶液和试样溶液测定
在仪器的最佳条件下，分别取标准系列溶液（5.10）和试样溶液（8.2）上机测定。乳铁蛋白标准溶液高效液相色谱图见附录A。
8.3.2.2 定性
以保留时间定性，试样溶液中乳铁蛋白保留时间应与标准系列溶液（浓度相当）中乳铁蛋白的保留时间一致，其相对偏差在±2.5%之内。
8.3.2.3 定量
以乳铁蛋白的浓度为横坐标、色谱峰面积（响应值）为纵坐标，绘制标准曲线，其相关系数应不低于0.99。试样溶液中待测物的浓度应在标准曲线的线性范围内。如超出范围，应将试样溶液用洗脱溶液稀释后，重新测定（或重新试验）。
9试验数据处理
试样中乳铁蛋白的含量以质量分数ω计，单位为毫克每千克（mg/kg） ，按公式（1）计算。
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式中：
ρ——被测组分曲线计算浓度的数值，单位为毫克每升（mg/L）；
V3——上机液定容体积的数值，单位为毫升（mL）；
V1——试样处理液总体积的数值，单位为毫升（mL）；
m——试样质量的数值，单位为克（g）；
V2——样液过柱体积的数值，单位为毫升（mL）；
1 000——换算系数；
f——稀释倍数。
测定结果以平行测定的算术平均值表示，计算结果保留3位有效数字。
10 精密度
在重复性条件下获得的2次独立测试结果的绝对差值不大于算术平均值的15%。
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