中华人民共和国农业行业标准
NY/T 4360-2023
饲料中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的测定 液相色谱-串联质谱法
Determination of streptomycin, dihydrostreptomycin and kanamycin in feeds-Liquid chromatography-tandem mass spectrometry
(转载自:https://t.cn/A6jLRopn)

前言

本文件按照GB/T 1.1-2020《标准化工作导则第 1部分:标准化文件的结构和起草规则》的规定起草。

请注意本文件的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。

本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。

本文件由全国饲料工业标准化技术委员会(SAC/TC 76)归口。

本文件起草单位:江苏省农业科学院。

本文件主要起草人:魏瑞成、栾枫婷、王冉、龚兰、何涛、朱磊、唐敏敏。

1范围

本文件描述了饲料中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的液相色谱-串联质谱测定方法。

本文件适用于配合饲料、浓缩饲料、精料补充料和添加剂预混合饲料中链霉素、双氢链霉素和卡那霉素的测定。

本文件的检出限为0.05 mg/kg,定量限为0.1 mg/kg。

2规范性引用文件

下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中,注日期的引用文件,仅该日期对应的版本适用于本文件;不注日期的引用文件,其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。

GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法

GB/T 20195 动物饲料 试样的制备

3术语和定义

本文件没有需要界定的术语和定义。

4原理

试样中的链霉素、双氢链霉素和卡那霉素用混合提取溶液提取,经亲水-亲脂平衡型固相萃取柱净化,用液相色谱-串联质谱仪检测,基质匹配标准游液校准,外标被定量。

5试剂或材料

除非另有规定,仅使用分析纯试剂。与链霉素、双氢链霉素和卡那霉素溶液接触的容器应使用聚丙烯材质。

5.1水:GB/T 6682,一级。

5.2甲醇:色谱纯。

5.3乙腈:色谱纯。

5.4甲酸:色谱纯。

5.5乙酸铵:色谱纯。

5.6异丙醇:色谱纯。

5.7磷酸二氢钾溶液(0.2 mol/L):称取2.72 g磷酸二氢钾,加水溶解并稀释至100 mL,混匀。

5.8乙二胺四乙酸二钠溶液(0.2 mol/L):称取6.72 g乙二胺四乙酸二钠,加水溶解并稀释至100 mL,混匀。

5.9 20%三氯乙酸溶液:称取200 g三氯乙酸,加水溶解并稀释至1 000 mL,混匀。

5.10 混合提取溶液:量取50 mL磷酸二氢钾溶液(5.7)、10 mL乙二胺四乙酸二钠溶液(5.8)和500 mL三氯乙酸溶液(5.9),加水至900 mL,混勾,用氨水调节pH至7.50±0.20,用水稀释、定容至1 000 mL, 混匀。

5.11 10%甲醇溶液:取10 mL甲醇(5.2),加水稀释至100 mL,混匀。

5.12乙酸铵溶液(0.1 mol/L):称取0.77 g乙酸铵(5.5),加水溶解并稀释至100 mL,混匀。

5.13乙酸铵溶液(0. 002 mol/L) :移取2 mL乙酸铵溶液(5.12) ,加水稀释至100 mL,混匀。

5.14洗脱溶液:取10 mL甲酸(5.4)、5 mL异丙醇(5.6)和85 mL乙酸铵溶液(5.13)混合,用甲酸调节pH至0.80±0.10,混匀。

5.15乙酸铵-甲酸溶液:移取10 mL乙酸铵溶液(5.12)、5 mL甲酸(5.4) ,用水稀释并定容至500 mL混匀。

5.16乙酸铵-甲酸乙腈溶液:移取10 mL乙酸铵溶液(5.12),5 mL甲酸(5.4),用乙腈(5.3)稀释并定容至500 mL,混匀。

5.17标准储备溶液(1 mg/mL):准确称取硫酸链霉素(CAS号: 3810-74-0,纯度不低于99%)、硫酸双氢链霉素(CAS号:5490-27-7,纯度不低于97%)和单硫酸卡那霉素(CAS号: 25389-94-0,卡那霉素A纯度不低于96%)标准品或对照品各10 mg(以有效成分计,精确至0.01 mg) ,分别于10 mL聚丙烯容量瓶中,用水溶解,定容,混匀。储存于聚丙烯瓶中,2℃~8℃保存,有效期1个月。

5.18混合标准中间溶液(10 μg/mL):准确移取硫酸链霉素、硫酸双氢链霉素和单硫酸卡那霉素标准储备溶液(5.17)1 mL于100 mL聚丙烯容量瓶中,用洗脱溶液(5.14)稀释至刻度,混匀。储存于聚丙烯瓶中,2℃~8℃保存,有效期1周。

5.19混合标准系列工作溶液:准确移取适量体积的混合标准中间溶液(5.18)于10mL聚丙烯容量瓶中,用洗脱溶液(5.14)稀释配制成浓度分别为100 ng/mL、200 ng/mL、500 ng/mL、1 0000 ng/mL、2 50ng/mL、5 000 ng/mL混合标准系列工作溶液。临用现配。

5.20固相萃取小柱:亲水亲脂(HLB)平衡型固相萃取柱,500 mg/6 mL。

5.21尼龙微孔滤膜:0.22 μm。

6仪器设备

6.1液相色谱-串联质谱仪:配有电喷雾离子源。

6.2分析天平:精度0.1 mg和0.01 mg。

6.3涡旋混合器。

6.4超声波清洗器。

6.5离心机:转速不低于 10 000 r/min。

6.6固相萃取装置。

6.7氮吹仪。

6.8酸度计:精度 0. 01。

7样品

按GB/T 20195的规定制备样品,至少200g,粉碎使其全部通过0.425mm孔径的分析筛,充分混匀,装入密闭容器中,备用。选取与待测样品类型相同,均匀一致,且在待测物保留时间处仪器响应值小于方法定量限30%的饲料样品,作为基质空白样品。

8试验步骤

8.1提取

平行做2份试验。称取2 g(精确至0.1 mg)试样于50 mL聚丙烯离心管中,准确加入30 mL混合提取溶液(5.10),涡旋混合1 min,超声提取15 min,其间充分摇动2次,于10 000 r/min 离心10 min,准确移取15 mL上清液,用20%三氯乙酸溶液(5.9)调节pH至6.50±0.10,备用。

8.2 净化

依次用5 mL甲醇(5.2)和5 mL水活化固相萃取小柱(5.20),将备用液(8.1)全部过柱,用5 mL水、5 mL 10%甲醇溶液(5.11)分别淋洗,真空负压抽干,准确移取5 mL洗脱溶液(5.14)进行洗脱,收集洗脱液,再次真空负压抽干,涡旋混合1 min,过微孔滤膜(5.21),待测。

8.3基质匹配标准系列溶液的制备

取基质空白试样,按8.1和8.2处理得到空白基质溶液。准确移取混合标准系列工作溶液(5.19)各100 μL分别置于1.5 mL聚丙烯进样瓶,用氮气吹干,准确加入1 mL空白基质溶液,涡旋混合30 s,配制成浓度为10 ng/mL、20 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/ mL、250 ng/mL、500 ng/ mL的基质匹配标准系列溶液,待测。

8.4测定

8.4.1液相色谱参考条件

色谱柱:酰胺柱,柱长100 mm,内径2.1 mm,粒度1.7 μm;或者性能相当者。

柱温:35℃。

流速:0.3 mL/ min。

进样量:4 μL。

流动相:A相为乙酸铵-甲酸溶液(5.15);B相为乙酸铵-甲酸乙腈溶液(5.16)。

梯度洗脱:洗脱程序见表1。

image.png

8. 4.2质谱参考条件

电离方式:电喷雾电离,正离子模式(ESI+ )。

检测方式:多反应监测(MRM)。

喷雾电压:5.5 kV。

雾化温度:550℃。

多反应监测(MRM)离子对、去簇电压及碰撞能量见表2。

image.png

8.4.3基质匹配标准 系列溶液和试样溶液测定

在仪器的最佳条件下,分别取基质匹配标准系列溶液(8.3)和试样溶液(8.2)上机测定。基质匹配标准溶液的定量离子色谱图见附录A。

8.4.4 定性

在相同试验条件下,试样溶液与基质匹配标准系列溶液中待测物的保留时间相对偏差应在±2.5%之内。根据表2选择的定性离子对,比较试样谱图中待测物定性离子的相对离子丰度与浓度接近的基质匹配标准系列溶液中对应的定性离子的相对离子丰度,若偏差不超过表3规定的范围,则可判定为样品中存在对应的待测物。

8.4.5 定量

以浓度为横坐标、色谱峰面积(响应值)为纵坐标。绘制标准曲线。标准曲线的相关系数应不低于0.99。试样溶液与基质匹配标准溶液申待测物的响应值均应在仪器检测的线性范围内。如超出线性范围,应将试样和基质空白样品净化(8.2)得到的溶液用洗脱溶液作同比例稀释后,从“8. 3”开始按步骤重新测定。单点校准定量时,试样溶液中待测物的峰面积基质匹配标准溶液的峰面积相差不超过30%。

9试验数据处理

试样中链霉素、双氢链霉素、卡那霉素A的含量以质量份数ωi计,单位为毫克每千克(mg/kg)。标准曲线校准按公式(1)计算;单点校推按公式(2)计算。

image.png

式中:

ρi——由基质匹配标准曲线得到的试样溶液中待测物质量浓度的数值,单位为纳克每毫升(ng/mL);

V——混合提取溶液体积的数值单位为毫升(mL);

V1——最终洗脱体积的数值单位为毫升(mL);

n——试样净化液稀释后的倍数;

V2——固相萃取净化时备用液体积的数值,单位为毫升(mL);

n——试样质量的数值,单位为克(g);

image.png

式中:

Ai——试样溶液中待测物的色谱峰面积:

ρsi——基质匹配标准落液中待测物质量浓度的数值,单位为纳克每毫升( ng/mL);

V——混合提取溶液体积的数值,单位为毫升(mL);

V1——最终洗脱体积的数值,单位为(mL);

n——试样净化液稀释后的倍数;

V2——固相萃取净化时备用液体积的数值, 单位为毫升(mL);

Asi——基质匹配标准溶液中待测物的色谱峰面积;

m——试样质量的数值,单位为克(g)。

测定结果以平行测定的算术平均值表示,保留3位有效数字。

10 精密度

在重复性条件下,2次独立测定结果与其算术平均值的绝对差值不大于该算术平均值的20%。

#丞磊[超话]# 丞磊x杨辉翔
清晨,早七闹钟响起,一只手从被子里伸出在床头摸索着将震动的手机关闭,默了几秒后便起身。
在卫生间洗漱的时候,听见了从客房传来的动静,不一会儿就见丞磊就从客房里走出来,用毛巾胡乱的把脸上的水擦干后,向对方打了个招呼。“周一了,我今天要去上班了,你今天准备干什么啊”
丞磊刚睡醒还有点懵懵的感觉,和杨辉翔错身,直直进入卫生间。
杨辉翔看着丞磊的行径,不置可否。坐在沙发上打开电脑,检查今天上课要用的课件。
丞磊出来后,见对方在忙,也不打扰,进了厨房,为两人做早餐。说是做早餐其实也就是把前一天晚上买回来的包子热一下。
又是一阵闹铃响起,七点半了。
杨辉翔将整理好的课件存到U盘里,丞磊也将热好的包子端出来。
绝对的默契让两人少了很多交流,甚至不需要过多的眼神,看见对方在做什么,便知道自己该做什么。
两人默默的吃着包子,倒也不尴尬。
“我想和你一起去学校,可以吗?不可以的话我就在家里待着”,丞磊突然说。
杨辉翔听着对方的话,思索了一下,“可以啊,正好周一忙,你还能帮我忙。哦对了,一起去的话记得拿头盔,楼下只有一个头盔。”
丞磊笑“不愧是人民教师这么遵守交通规则”,杨辉翔闻言也是一笑。
早餐是丞磊做的,自然就不需要他来收拾,丞磊几口解决掉手中的包子后,就回了自己的房间收拾。
两人赶在7:40前出了家门,杨辉翔先将电动车推出来,坐好后招呼丞磊,“走吧。”
到了校门口,杨辉翔和丞磊都下车,杨辉翔推着车和值班老师点头致意,丞磊有样学样的向值班老师点头致意,值班老师看着两个“杨老师”,有一瞬的呆愣,刚想开口询问,杨辉翔早拉上丞磊骑车离去。
丞磊一路乖巧的跟着杨辉翔,看着学生向杨辉翔打招呼后,杨辉翔礼貌应答;看着别的老师遇到杨辉翔和他闲谈,询问他是否要去签到,能否帮自己签一下,杨辉翔满口答应;看着他轻车熟路的帮自己和他人签到……
等到杨辉翔终于坐到办公室,才问道
“怎么这么安静啊
丞磊在办公室里好奇地四处看看
“想看人民教师的工作日常,当然不能打扰你呀。”
杨辉翔将外套脱下,换上办公室里挂着的针织开衫
“把羽绒服脱了吧,学校到处都有暖气,穿这就太厚了,我这儿还有备用的衣服,你穿着。”
“我过会有任课组长会,两节课后是升旗仪式,你就不出去了,办公室有广播有国旗,三四节课的时候我就有课了,到时候你是要待在办公室还是跟我一起去上课?”
丞磊边换上杨辉翔的衣服,边说“你先去忙吧,我过会儿和你一起去上课吧,我就坐最后面,不用管我。”
这时有老师来敲门,“杨老师走去开会了!”杨辉翔应了一声,拿着笔记本和笔便出去了。
等到第三节课的预备铃声响起,杨辉翔才赶回来,拿起课本向美术教室走去。
丞磊跟在杨辉翔后面,进了教室,学生们正三五成群的一组一组的进入教室,等正式铃打响的时候,学生也差不多到齐了,杨辉翔把门一关。
“上课。”
“起立!”“老师好。”
“你们好,同学们请坐”“都带书了吗?没带书的和同桌看一本,把书翻到……”
……
丞磊坐在最后一排,撑着脸看杨辉翔向学生讲述理论知识。等到课间的时候,丞磊随着学生走出教室,杨辉翔看见,也不多加阻拦,坐在凳子上调整自己。没过一会儿丞磊又回来了,手里拿着素描本,杨辉翔有心想打趣丞磊,可不断有学生拿着这次比赛的参赛作品来找杨辉翔修改,一时竟顾不上丞磊。
下课铃声响起,一早上就这样过去了,杨辉翔把教案整理了一下回到办公室,拿出饭卡给丞磊
“过会应该有学生来找我,你去食堂吃饭吧,顺便帮我买个饼,随便夹点东西就行,辛苦了。”“哦对了你知道食堂在哪儿吗…”
丞磊打断杨辉翔的话
“我今早把学校转了一下,知道食堂在哪儿,你少说点话吧嗓子都有点哑了,杯子里的水凉了记得掺点热水,走了”
杨辉翔在丞磊身后“期待帅哥投喂”
杨辉翔在丞磊面前贫个嘴,可当有学生来的时候还是立马正色,脾气温和地和学生说着如何修改作品。
直到最后一个学生离开,杨辉翔才有时间停下来吃饭。咬下去第一口
“帅哥你好懂我啊!都是我爱吃的!哈哈哈,走吧回宿舍,下午事更多”
说着便大步流星的走出办公室。丞磊帮他把保温杯带上
“大哥你杯子不要了啊?”
杨辉翔站定回头
“我这不是在考验你嘛,你经过考验了!我认下你这个小弟了哈哈哈哈”
下午杨辉翔的确更忙了,上课,开会,还要挤着时间给学生修改作品,水都没喝上几口。更别说坐着休息了。丞磊一下午也不出去 就窝在办公室画画,直到下班杨辉翔才停止忙碌。和丞磊去食堂吃了晚饭,再买了饼给明早早餐做准备,打工人的一天就结束了。
晚上回家,两人一个画画一个准备课件,客厅的灯光照在两人身上,照在两人手中的物
物品上,没人说话,只有画笔摩擦过画纸的沙沙声和敲击键盘的哒哒声。
丞磊先停笔,看了眼时间,为两人分别倒杯水,特别给杨辉翔的杯子里加了点蜂蜜,放到他的电脑旁,“晚安,早点休息”便回了房间。
过了一会儿,杨辉翔关了电脑,拿起水杯,将客厅的灯关掉,走进了房间。
屋子渐渐与安静的夜晚融为一体。

#丞磊[超话]# 根据一位走艺术道路的朋友的答复,开个脑洞,写个小片段呀~轻喷[老师好]

丞磊x杨辉翔

清晨,早七的闹钟响起,一只手从被子里伸出,在床头摸索着将震动的手机关闭,翻个身,默了几秒便起身。

在卫生间洗漱的时候,听见了从客房传来的动静,不一会儿就见丞磊就从客房里走出来,用毛巾胡乱的把脸上的水擦干后,向对方打了个招呼。

“周一了,我今天要去上班了,你今天准备干什么啊”

丞磊刚睡醒还有点懵懵的感觉,和杨辉翔错身,直直进入卫生间。

杨辉翔看着丞磊的行径,不置可否。坐在沙发上打开电脑,检查今天上课要用的课件。

丞磊出来后,见对方在忙,也不打扰,进了厨房,为两人做早餐。说是做早餐其实也就是把前一天晚上买回来的包子热一下。

又是一阵闹铃响起,七点半了。

杨辉翔将整理好的课件存到U盘里,丞磊也将热好的包子端出来。

绝对的默契让两人少了很多交流,甚至不需要过多的眼神,看见对方在做什么,便知道自己该做什么。

两人默默的吃着包子,倒也不尴尬。

“我想和你一起去学校,可以吗?不可以的话我就在家里待着”,丞磊突然说。

杨辉翔听着对方的话,思索了一下,“可以啊,正好周一忙,你还能帮我忙。哦对了,一起去的话记得拿头盔,楼下只有一个头盔。”

丞磊笑“不愧是人民教师这么遵守交通规则”,杨辉翔闻言也是一笑。

早餐是丞磊做的,自然就不需要他来收拾,丞磊几口解决掉手中的包子后,就回了自己的房间收拾。

两人赶在7:40前出了家门,杨辉翔先将电动车推出来,坐好后招呼丞磊,“走吧。”

到了校门口,杨辉翔和丞磊都下车,杨辉翔推着车和值班老师点头致意,丞磊有样学样的向值班老师点头致意,值班老师看着两个“杨老师”,有一瞬的呆愣,刚想开口询问,杨辉翔早拉上丞磊骑车离去。

丞磊一路乖巧的跟着杨辉翔,看着学生向杨辉翔打招呼后,杨辉翔礼貌应答;看着别的老师遇到杨辉翔和他闲谈,询问他是否要去签到,能否帮自己签一下,杨辉翔满口答应;看着他轻车熟路的帮自己和他人签到……

等到杨辉翔终于坐到办公室,才问道
“怎么这么安静啊”

丞磊在办公室里好奇地四处看看
“想看人民教师的工作日常,当然不能打扰你呀。”

杨辉翔将外套脱下,换上办公室里挂着的针织开衫
“把羽绒服脱了吧,学校到处都有暖气,穿这就太厚了,我这儿还有备用的衣服,你穿着。”
“我过会有任课组长会,两节课后是升旗仪式,你就不出去了,办公室有广播有国旗,三四节课的时候我就有课了,到时候你是要待在办公室还是跟我一起去上课?”

丞磊边换上杨辉翔的衣服,边说“你先去忙吧,我过会儿和你一起去上课吧,我就坐最后面,不用管我。”

这时有老师来敲门,“杨老师走去开会了!”杨辉翔应了一声,拿着笔记本和笔便出去了。

等到第三节课的预备铃声响起,杨辉翔才赶回来,拿起课本向美术教室走去。

丞磊跟在杨辉翔后面,进了教室,学生们正三五成群的一组一组的进入教室,等正式铃打响的时候,学生也差不多到齐了,杨辉翔把门一关。
“上课。”
“起立!”“老师好。”
“你们好,同学们请坐”“都带书了吗?没带书的和同桌看一本,把书翻到……”

……

丞磊坐在最后一排,撑着脸看杨辉翔向学生讲述理论知识。等到课间的时候,丞磊随着学生走出教室,杨辉翔看见,也不多加阻拦,坐在凳子上调整自己。没过一会儿丞磊又回来了,手里拿着素描本,杨辉翔有心想打趣丞磊,可不断有学生拿着这次比赛的参赛作品来找杨辉翔修改,一时竟顾不上丞磊。

下课铃声响起,一早上就这样过去了,杨辉翔把教案整理了一下回到办公室,拿出饭卡给丞磊
“过会应该还会有学生来找我,你去食堂吃饭吧,顺便帮我在食堂买个饼,随便加点东西就行,辛苦了。”“哦对了你知道食堂在哪儿吗一样…”

丞磊打断杨辉翔的话
“我今早把学校大概转了一下,知道食堂在哪儿,你少说点话吧,嗓子都有点哑了,杯子里的水凉了,记得掺点热水,走了,拜拜”

杨辉翔在丞磊身后“期待帅哥投喂啊”

杨辉翔在丞磊面前贫个嘴,可当有学生来的时候还是立马正色,脾气温和地和学生说着如何修改作品。

直到最后一个学生离开,杨辉翔才有时间停下来吃饭。咬下去第一口
“帅哥你好懂我啊!都是我爱吃的!哈哈哈,走吧回宿舍,下午事更多”

说着便大步流星的走出办公室。丞磊帮他把保温杯带上
“大哥你杯子不要了啊?”

杨辉翔站定回头
“我这不是在考验你嘛,你经过考验了!我认下你这个小弟了哈哈哈哈”

丞磊无语,丞磊不想搭理这个人。可是丞磊不知道杨辉翔的宿舍在几楼,还得跟在杨辉翔身后,幸好杨辉翔也急着回去休息,也没再逗丞磊。

下午杨辉翔的确更忙了,上课,开会,还要挤着时间给学生修改作品,水都没喝上几口。更别说坐着休息了。丞磊一下午也不出去 就窝在办公室画画,直到下班杨辉翔才停止忙碌。和丞磊去食堂吃了晚饭,再买了饼给明早早餐做准备,打工人的一天就结束了。

晚上回家,两人一个画画一个准备课件,客厅的灯光照在两人身上,照在两人手中的物
物品上,没人说话,只有画笔摩擦过画纸的沙沙声和敲击键盘的哒哒声。

丞磊先停笔,看了眼时间,为两人分别倒了杯水,特别给杨辉翔的杯子里加了点蜂蜜,放到他的电脑旁,轻轻地说上一句“晚安,早点休息”便回了房间。

过了一会儿,杨辉翔关了电脑,拿起水杯,将客厅的灯关掉,走进了房间。

屋子渐渐与安静的夜晚融为一体


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