RNA sequencing:
第一代测序技术（sanger测序）：
优点：测序读长（可达1000bp)、测序准确率(高达99.999%）
缺点：测序成本高、通量（仪器一次测序产生的总数据量）低等缺点导致无法大规模应用。
第二代测序技术（NGS）：
优点：测序速度快、成本低、准确性高
缺点：测序读长短很多（一般100-150bp）。
目前illumina是NGS的主流公司（采用Hisq技术），仪器方法：边合成边测序
NGS大致流程：
（10X公司的NGS技术）
10X单细胞RNA测序技术的核心：微流控技术。mRNA穿过细胞核进入细胞质进行翻译，然后mRNA和beads结合成凝珠进行测序（可以认为借助凝珠辨别出单细胞）。
1. 10X的单细胞RNA-seq原理详解：（如图1 10X的 scRNA-seq流程）
2. 10X的scRNA-seq流程：为了保证细胞在标记的过程中是单独分开的，10X公司开发了微流体设备（microfuidic device）进行预处理，设备有三个上样孔，可以分别加入你的1.样本细胞悬液（Sample）2.凝胶小球（Beads) 3.分离液（Oil）,（图2 微流体设备（microfuidic device)）
当我们把样本细胞悬液加入设备时，每一个细胞会与凝胶小球单独结合，然后被分离液包裹，形成一个油包水的密闭小液滴（droplet）。
进一步地，细胞和凝胶小球相遇不久后会裂解，释放出里面的各种物质，各种RNA，蛋白质，脂质，DNA等。
Beads上联接了不同的接头，其中有一个接头包含ploy(dT)序列，在细胞裂解后释放的核酸中，只有mRNA带有polyA tail，于是Beads的poly(dT)接头就可以从众多的裂解产物里捕获到mRNA（实际上drop-seq采用3’端测序，就是为了检测polyA tail）
Master Mix中带有反转录试剂，当mRNA被捕获后，就可以从它的3‘端开始作为模板，进行反转录出cDNA的第一条链，这第一条链就沿着poly(dT)序列延申，长在了beads上，形成了图一7中的STAMPs，接着我们把反转录出来的cDNA序列洗脱，以cDNA的第一条链为模板，进行PCR，合成cDNA的第二条链，然后就是我们熟悉的cDNA扩增以及illumina测序。
那么如何确定测序序列来自哪个细胞？single cell的RNA-seq和bulk的RNA-seq的最大区别是什么？是barcode,或者说是cell barcode（实际上DNA自带barcode, cell barcode是人为控制的）。每一种single cell的beads上都有着相同的cell barcode (beads与beads间的cell barcode是不同的)，假设每个beads只捕获一个cell，那么则每个cell都被cell barcode单独标记了。
如何保证每个beads只捕获一个cell？第一是控制cell和beads的流速，第二是beads的数目远远超过cell的数目，即绝大多数的beads都是空的，只有少数的才捕获到了cell。但是还是有个别的droplet里面会有两个或者更多的细胞，这就需要进行质控（Quality Control）。
接下来可以参照10X Genomics的说明书详解single cell RNA-seq的barcode，实际上Beads上一开始只接了Read1、Barcode、Poly(dT)。（图3 10X的cell barcode）
名词解释：
Poly(dT): 用来和mRNA的polyA结合，捕获mRNA
UMI：用来表不同的PCR产物（用于count计数）。为了减少由于复制引起的误差（重复抽样导致重复计数），人们在一些单细胞测序的步骤中增加了UMI（unique molecular identifiers）,UMIs是由4-10个随机核苷酸组成的序列，在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA，随机脸上一个UMI，因此可以计数不同的UMI，最终计数mRNA的数量。
10X Barcode:用来标记不同的single cell
Sample Index:用来标记不同的Sample
P5和P7：用来进行illuminate的桥式PCR测序
Truseq Read 1、2：用来进行连接beads，cDNA 的PCR扩增和加P7接头
在这些序列中，P5、P7、Truseq Read1、2的序列是已知的。其他的序列是怎么一步步添加上去的？
具体步骤：
图4
步骤1
图5
步骤2
图6
步骤3
图7 详解图
最后的测序数据（reads）从Truseq Read1后的10X Barcode开始，一直到Truseq Read2为止。
简单总结：PCR扩增是很关键的步骤，是对cDNA单联进行复制，后面的桥式PCR也很重要，是对完整的样本进行复制（增加数据深度），总的来说各个cDNA呈均匀分布，然后进行随机抽样。一般来说，RNA-seq的重复序列主要有PCR duplication（绝大部分）、cluster duplication和optical duplication。
RNA-seq的一些问题：
From：https://t.cn/A6K1xD2S
第一代测序技术（sanger测序）：
优点：测序读长（可达1000bp)、测序准确率(高达99.999%）
缺点：测序成本高、通量（仪器一次测序产生的总数据量）低等缺点导致无法大规模应用。
第二代测序技术（NGS）：
优点：测序速度快、成本低、准确性高
缺点：测序读长短很多（一般100-150bp）。
目前illumina是NGS的主流公司（采用Hisq技术），仪器方法：边合成边测序
NGS大致流程：
（10X公司的NGS技术）
10X单细胞RNA测序技术的核心：微流控技术。mRNA穿过细胞核进入细胞质进行翻译，然后mRNA和beads结合成凝珠进行测序（可以认为借助凝珠辨别出单细胞）。
1. 10X的单细胞RNA-seq原理详解：（如图1 10X的 scRNA-seq流程）
2. 10X的scRNA-seq流程：为了保证细胞在标记的过程中是单独分开的，10X公司开发了微流体设备（microfuidic device）进行预处理，设备有三个上样孔，可以分别加入你的1.样本细胞悬液（Sample）2.凝胶小球（Beads) 3.分离液（Oil）,（图2 微流体设备（microfuidic device)）
当我们把样本细胞悬液加入设备时，每一个细胞会与凝胶小球单独结合，然后被分离液包裹，形成一个油包水的密闭小液滴（droplet）。
进一步地，细胞和凝胶小球相遇不久后会裂解，释放出里面的各种物质，各种RNA，蛋白质，脂质，DNA等。
Beads上联接了不同的接头，其中有一个接头包含ploy(dT)序列，在细胞裂解后释放的核酸中，只有mRNA带有polyA tail，于是Beads的poly(dT)接头就可以从众多的裂解产物里捕获到mRNA（实际上drop-seq采用3’端测序，就是为了检测polyA tail）
Master Mix中带有反转录试剂，当mRNA被捕获后，就可以从它的3‘端开始作为模板，进行反转录出cDNA的第一条链，这第一条链就沿着poly(dT)序列延申，长在了beads上，形成了图一7中的STAMPs，接着我们把反转录出来的cDNA序列洗脱，以cDNA的第一条链为模板，进行PCR，合成cDNA的第二条链，然后就是我们熟悉的cDNA扩增以及illumina测序。
那么如何确定测序序列来自哪个细胞？single cell的RNA-seq和bulk的RNA-seq的最大区别是什么？是barcode,或者说是cell barcode（实际上DNA自带barcode, cell barcode是人为控制的）。每一种single cell的beads上都有着相同的cell barcode (beads与beads间的cell barcode是不同的)，假设每个beads只捕获一个cell，那么则每个cell都被cell barcode单独标记了。
如何保证每个beads只捕获一个cell？第一是控制cell和beads的流速，第二是beads的数目远远超过cell的数目，即绝大多数的beads都是空的，只有少数的才捕获到了cell。但是还是有个别的droplet里面会有两个或者更多的细胞，这就需要进行质控（Quality Control）。
接下来可以参照10X Genomics的说明书详解single cell RNA-seq的barcode，实际上Beads上一开始只接了Read1、Barcode、Poly(dT)。（图3 10X的cell barcode）
名词解释：
Poly(dT): 用来和mRNA的polyA结合，捕获mRNA
UMI：用来表不同的PCR产物（用于count计数）。为了减少由于复制引起的误差（重复抽样导致重复计数），人们在一些单细胞测序的步骤中增加了UMI（unique molecular identifiers）,UMIs是由4-10个随机核苷酸组成的序列，在mRNA反转录后，进入到文库中，每一个mRNA，随机脸上一个UMI，因此可以计数不同的UMI，最终计数mRNA的数量。
10X Barcode:用来标记不同的single cell
Sample Index:用来标记不同的Sample
P5和P7：用来进行illuminate的桥式PCR测序
Truseq Read 1、2：用来进行连接beads，cDNA 的PCR扩增和加P7接头
在这些序列中，P5、P7、Truseq Read1、2的序列是已知的。其他的序列是怎么一步步添加上去的？
具体步骤：
图4
步骤1
图5
步骤2
图6
步骤3
图7 详解图
最后的测序数据（reads）从Truseq Read1后的10X Barcode开始，一直到Truseq Read2为止。
简单总结：PCR扩增是很关键的步骤，是对cDNA单联进行复制，后面的桥式PCR也很重要，是对完整的样本进行复制（增加数据深度），总的来说各个cDNA呈均匀分布，然后进行随机抽样。一般来说，RNA-seq的重复序列主要有PCR duplication（绝大部分）、cluster duplication和optical duplication。
RNA-seq的一些问题：
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#历史上的今日#
1929年１ ２ 月 ２ ８ 日 、 ２ ９ 日 中 共 红 四 军 第 九 次 代 表 大 会 在 上 杭 古 田 召 开 。 会 上 ， 毛 泽 东 作 政 治 报 告 ， 朱 德 作 军 事 报 告 ， 陈 毅 传 达 中 央 九 月 来 信 以 及 中 央 关 于 开 除 取 消 派 陈 独 秀 等 党 籍 的 决 议 案 。 会 议 讨 论 了 中 央 的 指 示 ， 总 结 了 红 四 军 前 委 工 作 的 经 验 教 训 ， 一 致 通 过 了 毛 泽 东 起 草 的 八 个 决 议 案 （ 总 称 《 中 国 共 产党 红 军 第 四 军 第 九 次 代 表 大 会 决 议 案 》 ， 又 称 《 古 田 会 议 决 议 》 ， 其 中 第 一 部 分 《 关 于 纠 正 党 内 的 错 误 思 想 》 编 入 《 毛 泽 东 选 集 》 ） 。 古 田 会 议 决 议 的 主 要 内 容 包 括 ：
（ 一 ） 规 定 红 军 的 性 质 和 任 务 。 决 议 指 出 ， “ 红 军 是 一 个 执 行 革 命 的 政 治 任 务 的 武 装 集 团 ” ， “ 除 了 打 仗 消 灭 敌 人 军 事 力 量 之 外 ， 还 要 负 担 宣 传 群 众 、 组 织 群 众 、 武 装 群 众 、 帮 助 群 众 建 立 革 命 政 权 以 至 于 建 立
共 产 党 的 组 织 等 项 重 大 的 任 务 ” 。 决 议 批 判 了 不 重 视 根 据 地 建 设 的 流 寇 思 想 和 不 愿 做 群 众 工 作 的 错 误 倾 向 。
（ 二 ） 肯 定 党 对 红 军 的 领 导 原 则 。 决 议 强 调 必 须 从 思 想 上 、 政 治 上 进 行 党 的 建 设 ， 还 必 须 加 强 党 的 组 织 建 设 ， 指 出 要 在 红 军 中 健 全 党 的 各 级 组 织 ， “ 厉 行 集 中 指 导 下 的 民 主 生 活 ” 。 决 议 批 判 了 极 端 民 主 化 思 想 和 非 组 织 观 点 等 错 误 倾 向 。
（ 三 ） 明 确 军 事 和 政 治 的 关 系 。 决 议 指 出 ， “ 军 事 只 是 完 成 政 治 任 务 的 工 具 之 一 ” 。 决 议 批 判 了 “ 军 事 好 ， 政 治 自 然 会 好 ” 和 “ 司 令 部 对 外 ” 以 及 把 政 治 机 关 隶 属 于 军 事 机 关 的 单 纯 军 事 观 点 。 （ 四 ） 强 调 进 行 马 克 思 主 义 和 党 的 正 确 路 线 教 育 。 决 议 指 出 ， 红 军 党 内 “ 存 在 着 各 种 非 无 产 阶 级 的 思 想 ” ， 最 迫 切 的 问 题 是 教 育 的 问 题 ， 要 从 教 育 上 提 高 党 内 的 政 治 水 平 ， 使 党 员 的 思 想 和 党 内 的 生 活 都 政 治 化 、 科 学 化 。 决 议 对 各 种 错 误 思 想 的 表 现 、 根 源 作 了 分 析 ， 指 明 了 纠 正 的 方 法 。
（ 五 ） 确 立 红 军 处 理 军 内 关 系 、 军 民 关 系 和 瓦 解 敌 军 的 原 则 。 决 议 指 出 ， 红 军 官 兵 平 等 ， 官 长 应 爱 护 士 兵 ， 保 障 士 兵 的 民 主 权 利 ， 纠 正 打 骂 士 兵 等 旧 军 队 的 管 教 方 法 ， 士 兵 要 尊 重 官 长 ， 自 觉 接 受 管 理 ， 遵 守 纪 律 。 决 议 重 申 红 军 必 须 遵 守 三 大 纪 律 和 六 项 注 意 的 规 定 ， 坚 持 军 民 团 结 。 决 议 规 定 ， 优 待 俘 虏 兵 ， 不 准 没 收 他 们 个 人 的 财 物 ， 有 伤 给 予 医 治 ， 不 愿 当 红 军 的 发 给路 费 释 放 。
（ 六 ） 规 定 红 军 宣 传 工 作 的 任 务 。 决 议 指 出 ： “ 红 军 宣 传 工 作 的 任 务 ， 就 是 扩 大 政 治 影 响 争 取 广 大 群 众 。 由 这 个 宣 传 任 务 之 实 现 ， 才 可 以 实 现 组 织 群 众 、 武 装 群 众 、 建 立 政 权 、 消 灭 反 动 势 力 、 促 进 革 命 高 潮 等 红 军 的 总 任 务 。 ”
（ 七 ） 论 述 红 军 政 治 工 作 的 作 风 和 方 法 。 决 议 指 出 ， 要 “ 用 马 克 思 列 宁 主 义 的 方 法 去 作 政 治 形 势 的 分 析 和 阶 级 势 力 的 估 量 ， 以 代 替 主 观 主 义 的 分 析 和 估 量 ” ， 要 注 意 对 实 际 情 况 的 调 查 研 究 ， “ 党 内 批 评 要 防 止 主 观 武 断 和 把 批 评 庸 俗 化 ” 。 这 个 决 议 解 决 了 以 农 民 为 主要 成 分 的 革 命 军 队 如 何 建 成 无 产 阶 级 性 质 的 新 型 人 民 军 队 的 问 题 ， 是 红 军 （ 后 来 的 八 路 军 、 新 四 军 ， 人 民 解 放 军 ） 建 设 的 纲 领 性 文 件 。 同 时 ， 这 个 决 议 为 整 个 党 的 建 设 确 立 了 一 条 马 克 思 列 宁 主 义 的 路 线 ， 也 是 党 的 建 设 的 纲 领 性 文 件 。
大 会 选 举 毛 泽 东 、 朱 德 、 陈 毅 、 罗 荣 桓 、 林 彪 、 伍 中 豪 、 谭 震 林 等 十 一 人 为 中 共 红 四 军 前 委 委 员 ， 毛 泽 东 重 新 当 选 前 委 书 记 。
1929年１ ２ 月 ２ ８ 日 、 ２ ９ 日 中 共 红 四 军 第 九 次 代 表 大 会 在 上 杭 古 田 召 开 。 会 上 ， 毛 泽 东 作 政 治 报 告 ， 朱 德 作 军 事 报 告 ， 陈 毅 传 达 中 央 九 月 来 信 以 及 中 央 关 于 开 除 取 消 派 陈 独 秀 等 党 籍 的 决 议 案 。 会 议 讨 论 了 中 央 的 指 示 ， 总 结 了 红 四 军 前 委 工 作 的 经 验 教 训 ， 一 致 通 过 了 毛 泽 东 起 草 的 八 个 决 议 案 （ 总 称 《 中 国 共 产党 红 军 第 四 军 第 九 次 代 表 大 会 决 议 案 》 ， 又 称 《 古 田 会 议 决 议 》 ， 其 中 第 一 部 分 《 关 于 纠 正 党 内 的 错 误 思 想 》 编 入 《 毛 泽 东 选 集 》 ） 。 古 田 会 议 决 议 的 主 要 内 容 包 括 ：
（ 一 ） 规 定 红 军 的 性 质 和 任 务 。 决 议 指 出 ， “ 红 军 是 一 个 执 行 革 命 的 政 治 任 务 的 武 装 集 团 ” ， “ 除 了 打 仗 消 灭 敌 人 军 事 力 量 之 外 ， 还 要 负 担 宣 传 群 众 、 组 织 群 众 、 武 装 群 众 、 帮 助 群 众 建 立 革 命 政 权 以 至 于 建 立
共 产 党 的 组 织 等 项 重 大 的 任 务 ” 。 决 议 批 判 了 不 重 视 根 据 地 建 设 的 流 寇 思 想 和 不 愿 做 群 众 工 作 的 错 误 倾 向 。
（ 二 ） 肯 定 党 对 红 军 的 领 导 原 则 。 决 议 强 调 必 须 从 思 想 上 、 政 治 上 进 行 党 的 建 设 ， 还 必 须 加 强 党 的 组 织 建 设 ， 指 出 要 在 红 军 中 健 全 党 的 各 级 组 织 ， “ 厉 行 集 中 指 导 下 的 民 主 生 活 ” 。 决 议 批 判 了 极 端 民 主 化 思 想 和 非 组 织 观 点 等 错 误 倾 向 。
（ 三 ） 明 确 军 事 和 政 治 的 关 系 。 决 议 指 出 ， “ 军 事 只 是 完 成 政 治 任 务 的 工 具 之 一 ” 。 决 议 批 判 了 “ 军 事 好 ， 政 治 自 然 会 好 ” 和 “ 司 令 部 对 外 ” 以 及 把 政 治 机 关 隶 属 于 军 事 机 关 的 单 纯 军 事 观 点 。 （ 四 ） 强 调 进 行 马 克 思 主 义 和 党 的 正 确 路 线 教 育 。 决 议 指 出 ， 红 军 党 内 “ 存 在 着 各 种 非 无 产 阶 级 的 思 想 ” ， 最 迫 切 的 问 题 是 教 育 的 问 题 ， 要 从 教 育 上 提 高 党 内 的 政 治 水 平 ， 使 党 员 的 思 想 和 党 内 的 生 活 都 政 治 化 、 科 学 化 。 决 议 对 各 种 错 误 思 想 的 表 现 、 根 源 作 了 分 析 ， 指 明 了 纠 正 的 方 法 。
（ 五 ） 确 立 红 军 处 理 军 内 关 系 、 军 民 关 系 和 瓦 解 敌 军 的 原 则 。 决 议 指 出 ， 红 军 官 兵 平 等 ， 官 长 应 爱 护 士 兵 ， 保 障 士 兵 的 民 主 权 利 ， 纠 正 打 骂 士 兵 等 旧 军 队 的 管 教 方 法 ， 士 兵 要 尊 重 官 长 ， 自 觉 接 受 管 理 ， 遵 守 纪 律 。 决 议 重 申 红 军 必 须 遵 守 三 大 纪 律 和 六 项 注 意 的 规 定 ， 坚 持 军 民 团 结 。 决 议 规 定 ， 优 待 俘 虏 兵 ， 不 准 没 收 他 们 个 人 的 财 物 ， 有 伤 给 予 医 治 ， 不 愿 当 红 军 的 发 给路 费 释 放 。
（ 六 ） 规 定 红 军 宣 传 工 作 的 任 务 。 决 议 指 出 ： “ 红 军 宣 传 工 作 的 任 务 ， 就 是 扩 大 政 治 影 响 争 取 广 大 群 众 。 由 这 个 宣 传 任 务 之 实 现 ， 才 可 以 实 现 组 织 群 众 、 武 装 群 众 、 建 立 政 权 、 消 灭 反 动 势 力 、 促 进 革 命 高 潮 等 红 军 的 总 任 务 。 ”
（ 七 ） 论 述 红 军 政 治 工 作 的 作 风 和 方 法 。 决 议 指 出 ， 要 “ 用 马 克 思 列 宁 主 义 的 方 法 去 作 政 治 形 势 的 分 析 和 阶 级 势 力 的 估 量 ， 以 代 替 主 观 主 义 的 分 析 和 估 量 ” ， 要 注 意 对 实 际 情 况 的 调 查 研 究 ， “ 党 内 批 评 要 防 止 主 观 武 断 和 把 批 评 庸 俗 化 ” 。 这 个 决 议 解 决 了 以 农 民 为 主要 成 分 的 革 命 军 队 如 何 建 成 无 产 阶 级 性 质 的 新 型 人 民 军 队 的 问 题 ， 是 红 军 （ 后 来 的 八 路 军 、 新 四 军 ， 人 民 解 放 军 ） 建 设 的 纲 领 性 文 件 。 同 时 ， 这 个 决 议 为 整 个 党 的 建 设 确 立 了 一 条 马 克 思 列 宁 主 义 的 路 线 ， 也 是 党 的 建 设 的 纲 领 性 文 件 。
大 会 选 举 毛 泽 东 、 朱 德 、 陈 毅 、 罗 荣 桓 、 林 彪 、 伍 中 豪 、 谭 震 林 等 十 一 人 为 中 共 红 四 军 前 委 委 员 ， 毛 泽 东 重 新 当 选 前 委 书 记 。
#每日一片# 《致敬》[星星][星星][星星][星星][半星]（2021）韩国女导演申秀媛去年获得大钟奖最佳导演提名，并入围东京电影节最佳影片的一部有趣小品。故事的主角就是一位女导演，创作遇到瓶颈，家人又总拖她后腿。为了糊口，她接了一份修复老电影的活，给韩国电影史上真实存在的一部作品——1962年由韩国初代女导演洪恩远拍摄的《女法官》重新配音。为了致敬前辈，她尽心尽责地走访剧组老人，翻查胶片资料，一路坎坷悲欣交集。最终功夫不负有心人，一段韩国女导演的奋斗史与这部老电影一起重见天日。
剧本结构非常巧妙，真实的历史背景融于虚构的现代人物关系中。在故纸堆探秘拼凑的过程，本身就成了一部相当具有可看性的公路寻宝片。而在过去与现代之间处处互文的浓郁的电影情怀，更给一切都蒙上了迷人的文艺气质。
将两代女导演紧紧相连的除了那部老电影之外，还有时隔六十年依然未变的韩国女性职场困境。这层意义大大拔高了影片的主题，但最妙的还是申秀媛举重若轻的处理方式。她始终保持着轻快风趣的自嘲口吻，没有为了声张女权而做任何呐喊和煽情，只是把味道都慢慢炖进了这道献给电影艺术的佳肴之中。只须知味之人会心一笑，便已足够。（8.5/10）
剧本结构非常巧妙，真实的历史背景融于虚构的现代人物关系中。在故纸堆探秘拼凑的过程，本身就成了一部相当具有可看性的公路寻宝片。而在过去与现代之间处处互文的浓郁的电影情怀，更给一切都蒙上了迷人的文艺气质。
将两代女导演紧紧相连的除了那部老电影之外，还有时隔六十年依然未变的韩国女性职场困境。这层意义大大拔高了影片的主题，但最妙的还是申秀媛举重若轻的处理方式。她始终保持着轻快风趣的自嘲口吻，没有为了声张女权而做任何呐喊和煽情，只是把味道都慢慢炖进了这道献给电影艺术的佳肴之中。只须知味之人会心一笑，便已足够。（8.5/10）
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