FISH原则
荧光原位杂交（FISH）是一种使用荧光探针的技术，该探针与染色体的特殊位点结合，与探针具有高度的序列互补性。 荧光探针是用荧光基团标记的核酸，可以与特定的 DNA/RNA 序列结合。 因此，我们可以通过检测荧光基团来了解特定DNA序列在细胞中的位置和时间。 它是在 20 世纪 80 年代初开发的。 荧光显微镜可用于找出荧光探针与染色体结合的位置，流式细胞术可用于定量检测结合。 此 FISH 协议适用于流式细胞术检测和荧光显微镜检测中使用的 Cy5 和 FAM 标记探针。
图1.荧光原位杂交（FISH）示意图。
FISH protocol （用于荧光显微镜检测）
在 FISH 之前，通过用 500 µl 10% 中性缓冲福尔马林覆盖样品接触区域，标本在 25°C 下固定 30 分钟。
固定后，福尔马林被丢弃，标本在 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中清洗一次。
然后在杂交前将样品在乙醇中脱水（50%、80% 和 95% (v/v) 系列，在每个浓度下暴露于 300 µl 乙醇 3 分钟）。
标本在 55°C 下使用防潮密封的载玻片孵育室杂交 15 分钟。 简而言之，将 500 µl 体积的杂交缓冲液（0.7 M NaCl、0.1 M Tris [pH 8.0]、0.1% 十二烷基硫酸钠、10 mM EDTA，含有探针，预热至 55 ºC）应用于标本和腔室的表面盖子是密封的，在室内创造一个潮湿、温度可控的环境。
15 分钟后，取下盖子，用预热至 55ºC 的无探针杂交缓冲液短暂冲洗样品。
标本上杂交细胞在黑暗中用含有 1.5 µg ml-1 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 的约 30 µl 封固剂进行复染 10 分钟。
然后用盖玻片固定标本并使用荧光显微镜检查。
荧光原位杂交（FISH）是一种使用荧光探针的技术，该探针与染色体的特殊位点结合，与探针具有高度的序列互补性。 荧光探针是用荧光基团标记的核酸，可以与特定的 DNA/RNA 序列结合。 因此，我们可以通过检测荧光基团来了解特定DNA序列在细胞中的位置和时间。 它是在 20 世纪 80 年代初开发的。 荧光显微镜可用于找出荧光探针与染色体结合的位置，流式细胞术可用于定量检测结合。 此 FISH 协议适用于流式细胞术检测和荧光显微镜检测中使用的 Cy5 和 FAM 标记探针。
图1.荧光原位杂交（FISH）示意图。
FISH protocol （用于荧光显微镜检测）
在 FISH 之前，通过用 500 µl 10% 中性缓冲福尔马林覆盖样品接触区域，标本在 25°C 下固定 30 分钟。
固定后，福尔马林被丢弃，标本在 1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中清洗一次。
然后在杂交前将样品在乙醇中脱水（50%、80% 和 95% (v/v) 系列，在每个浓度下暴露于 300 µl 乙醇 3 分钟）。
标本在 55°C 下使用防潮密封的载玻片孵育室杂交 15 分钟。 简而言之，将 500 µl 体积的杂交缓冲液（0.7 M NaCl、0.1 M Tris [pH 8.0]、0.1% 十二烷基硫酸钠、10 mM EDTA，含有探针，预热至 55 ºC）应用于标本和腔室的表面盖子是密封的，在室内创造一个潮湿、温度可控的环境。
15 分钟后，取下盖子，用预热至 55ºC 的无探针杂交缓冲液短暂冲洗样品。
标本上杂交细胞在黑暗中用含有 1.5 µg ml-1 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 (DAPI) 的约 30 µl 封固剂进行复染 10 分钟。
然后用盖玻片固定标本并使用荧光显微镜检查。
FM4-64 是一种膜选择性红色荧光染料，属于苯乙烯基吡啶染料的 FM 家族。 FM4-64 广泛用于研究活体动物的胞吞作用和胞吐作用、囊泡运输和细胞器组织。可以与质膜及内膜细胞器特异进行结合并发出高强度荧光。
图1.FM 4-64荧光光谱
FM 4-64使用案例
图 2. 使用台盼蓝 (TB)、FM 4–64 和 SYTO 9 评估 (KFF)3K-FAM 渗透到大肠杆菌细胞中。(KFF)3K-FAM 渗透在 PBS 中以 2 μM 浓度在室温下进行 温度 (23°C) 1 小时。 未处理的大肠杆菌细胞和 SYTO 9 处理的细胞分别用作阴性 (NC) 和阳性对照 (PC)。 在 (KFF)3K-FAM 孵育后立即对 TB 和 FM 4-64 进行染色，并使用绿色 (G) 和红色 (R) 荧光通道捕获荧光显微镜图像。 通过明场 (BF) 图像确认细胞完整性。 (KFF)3K-FAM 渗透细胞和阴 性对照的图像是在相似的曝光时间捕获的，以便进行比较。 黄色箭头表示 (KFF)3K-FAM 渗透的细胞（活的），白色箭头表示 TB 染色的细胞（死的）。 比例尺为 5 μm。
图1.FM 4-64荧光光谱
FM 4-64使用案例
图 2. 使用台盼蓝 (TB)、FM 4–64 和 SYTO 9 评估 (KFF)3K-FAM 渗透到大肠杆菌细胞中。(KFF)3K-FAM 渗透在 PBS 中以 2 μM 浓度在室温下进行 温度 (23°C) 1 小时。 未处理的大肠杆菌细胞和 SYTO 9 处理的细胞分别用作阴性 (NC) 和阳性对照 (PC)。 在 (KFF)3K-FAM 孵育后立即对 TB 和 FM 4-64 进行染色，并使用绿色 (G) 和红色 (R) 荧光通道捕获荧光显微镜图像。 通过明场 (BF) 图像确认细胞完整性。 (KFF)3K-FAM 渗透细胞和阴 性对照的图像是在相似的曝光时间捕获的，以便进行比较。 黄色箭头表示 (KFF)3K-FAM 渗透的细胞（活的），白色箭头表示 TB 染色的细胞（死的）。 比例尺为 5 μm。
#化学每日一文# 长春大学勾东霞等：载刺五加/桂皮紫萁海藻酸钠/羧甲基壳聚糖水凝胶伤口敷料的制备及其性能研究
引用本文：张莉弘，窦信，邱鹏，等. 载刺五加/桂皮紫萁海藻酸钠/羧甲基壳聚糖水凝胶伤口敷料的制备及其性能研究[J]. 化学试剂, 2022, 44(11): 1577-1584。
DOI: 10.13822 /j.cnki.hxsj.2022.0230
背景介绍
伤口敷料是一类用于伤口修复的医用材料，其主要作用是吸收伤口渗出液防止感染周围正常皮肤，保护伤口免受细菌及尘粒等外源污染。水凝胶类敷料具有透气、维持伤口湿润环境等优势，已经成为一种新兴的伤口敷料。传统水凝胶敷料的制备多是基于化学合成类聚合物，生物相容性较差。同时，在制备中残留的化学试剂不仅会刺激伤口，还可能存在毒性。因此，使用天然高分子材料制备水凝胶敷料是目前研究的方向。羧甲基壳聚糖（CMCS）作为一种具有羧甲基官能团的水溶性壳聚糖，具有良好的抗菌性、无毒性、生物降解性和生物相容性，广泛应用于制备伤口修复的水凝胶。
文章亮点
1.选择海藻酸钠（SA）与羧甲基壳聚糖（CMCS）为原料，通过化学交联的方式制备水凝胶，负载1%刺五加/桂皮紫萁有效成分，制备载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶伤口敷料；
2. 不仅改善海藻酸钠水凝胶的力学性能，而且提高其对伤口修复的能力；
3. 为开发更安全、更高效的水凝胶敷料提供理论基础，在药物载体、生物医学等领域具有广阔的应用前景。
内容介绍
1实验部分
1.1 主要仪器与试剂
1.2 实验方法
1.2.1 SA/CMCS水凝胶的制备
将SA加入NaCl溶液，常温搅拌均匀制得3%SA溶液，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合溶液，4 ℃活化3 h；制备3%CMCS水溶液，混匀两种液体制备水凝胶。
将制备的SA/CMCS水凝胶负载1%刺五加/桂皮紫萁有效提取物，得到载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶。
1.2.2 抗拉伸强度的测定
室温下使用电子万能实验机对SA/CMCS水凝胶抗拉伸强度进行测试。将水凝胶制成10 mm×7 mm的矩形长条，置于电子万能实验机上测定抗拉伸强度，拉伸速度为500 mm/min。
1.2.3 SA/CMCS水凝胶制备条件的优化
1.2.3.1 单因素试验
以抗拉伸强度为指标，考察NaCl浓度（0.1%、0.5%、0.9%、1.3%、1.7%）、EDC/NHS添加量（1.5%、2.25%、3%、3.75%、4.5%）、m（SA）∶m（CMCS）=3:7、2:3、1:1、3:2、7:3，对SA/CMCS水凝胶抗拉伸强度的影响。
1.2.3.2 响应面试验
以抗拉伸强度为响应值，优化SA/CMCS水凝胶制备条件。基于单因素实验结果，选择每个相关变量的3个水平进行中心组合设计（Box-Behnken），以分析响应模式并建立模型。
1.2.4 傅里叶红外光谱测定（FT-IR）
室温下使用傅立叶变换红外光谱仪对干燥的水凝胶样品进行测试。以KBr作为背景，按质量比1 : 180的比例加入烘干的水凝胶和KBr混合研磨，磨匀后的粉末放入压片机，将压片后的样品进行测量。扫描范围400～4000 cm-1。
1.2.5 孔隙率测定
1.2.6 溶胀曲线的测定
1.2.7 体外药物累计释放测定
1.2.8 抑菌性测定
使用液体抑菌的方法测定水凝胶的抑菌率。选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，采用细菌的吸光度（OD值）法研究水凝胶的抗菌性能。
1.2.9 抗炎性测定
使用Raw264.7小鼠巨噬细胞测定NO释放量，评价水凝胶的抗炎作用。
1.2.10 细胞存活率测定
使用Raw264.7小鼠巨噬细胞测定水凝胶细胞相容性。
2结果与讨论
2.1 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶制备的最优条件
2.1.1 单因素试验
SA与CMCS质量比、NaCl浓度、EDC/NHS添加量均可影响水凝胶的抗拉伸强度。
2.1.2 响应面回归模型的建立与分析
根据单因素试验的结果，设计响应面试验，因素水平见表1，响应面试验结果见表2。
2.2 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料的FT-IR分析
空白和载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料的FT-IR如图3所示。
2.3 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料的孔隙率分析
空白和载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料的孔隙率结果如图4所示。
2.4 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料的溶胀度分析
水凝胶溶胀度能反映出水凝胶的吸水能力和孔结构。水凝胶中亲水性官能团，如羟基、氨基和酰胺基团使水凝胶吸收大量的水，导致水凝胶膨胀。在溶胀期间，水凝胶的交联网络结构能够防止水凝胶完全被破坏[23]。SA/CMCS水凝胶的溶胀曲线结果如图5所示。
2.5 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料药物释放分析
载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料在PBS中的累计释放曲线如图6所示，0～10 h刺五加/桂皮紫萁提取物的释放量随着时间的增加而均匀增加，释放速度基本恒定，呈零级释药状态，在10 h时释放率为（79.3±1.7）%；随着释放时间的延长，提取物的释放速率降低，趋近于0，当24 h时，药物累计释放率达到（93.34±2.4）%。
2.6 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料抑菌、抗炎作用分析
空白和载刺五加/桂皮紫萁水凝胶敷料的抑菌作用评价如图7a和7b所示。
2.7 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料生物相容性分析
在Raw264.7小鼠巨噬细胞上评价两种水凝胶敷料的生物相容性。
3结论
本文以水凝胶抗拉伸强度为响应值，优化出SA/CMCS水凝胶最佳制备条件为：NaCl浓度0.8%，EDC/NHS添加量2.25%，m（SA）∶m（CMCS）=1:1，此条件下水凝胶抗拉伸强度为0.884 MPa。在最佳条件下制备负载1%刺五加/桂皮紫萁提取物的水凝胶，FT-IR表明SA/CMCS水凝胶敷料已成功负载提取物，且未改变提取物的有效成分结构。SA/CMCS水凝胶敷料具有良好的吸收伤口组织液的作用，空白和载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶伤口敷料的溶胀度分别为（133±2.7）%和（135±3.6）%，孔隙率分别为（94.4±1.8）%和（90.5±1.2）%。载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料对提取物具有良好的缓释作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和NO的释放均具有较好的抑制作用，且具有良好的生物相容性。本研究结果表明，载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料具有良好的机械强度、理化性能和抑菌抗炎功能，具有开发成为新型伤口敷料的潜力。
引用本文：张莉弘，窦信，邱鹏，等. 载刺五加/桂皮紫萁海藻酸钠/羧甲基壳聚糖水凝胶伤口敷料的制备及其性能研究[J]. 化学试剂, 2022, 44(11): 1577-1584。
DOI: 10.13822 /j.cnki.hxsj.2022.0230
背景介绍
伤口敷料是一类用于伤口修复的医用材料，其主要作用是吸收伤口渗出液防止感染周围正常皮肤，保护伤口免受细菌及尘粒等外源污染。水凝胶类敷料具有透气、维持伤口湿润环境等优势，已经成为一种新兴的伤口敷料。传统水凝胶敷料的制备多是基于化学合成类聚合物，生物相容性较差。同时，在制备中残留的化学试剂不仅会刺激伤口，还可能存在毒性。因此，使用天然高分子材料制备水凝胶敷料是目前研究的方向。羧甲基壳聚糖（CMCS）作为一种具有羧甲基官能团的水溶性壳聚糖，具有良好的抗菌性、无毒性、生物降解性和生物相容性，广泛应用于制备伤口修复的水凝胶。
文章亮点
1.选择海藻酸钠（SA）与羧甲基壳聚糖（CMCS）为原料，通过化学交联的方式制备水凝胶，负载1%刺五加/桂皮紫萁有效成分，制备载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶伤口敷料；
2. 不仅改善海藻酸钠水凝胶的力学性能，而且提高其对伤口修复的能力；
3. 为开发更安全、更高效的水凝胶敷料提供理论基础，在药物载体、生物医学等领域具有广阔的应用前景。
内容介绍
1实验部分
1.1 主要仪器与试剂
1.2 实验方法
1.2.1 SA/CMCS水凝胶的制备
将SA加入NaCl溶液，常温搅拌均匀制得3%SA溶液，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐（EDC）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）混合溶液，4 ℃活化3 h；制备3%CMCS水溶液，混匀两种液体制备水凝胶。
将制备的SA/CMCS水凝胶负载1%刺五加/桂皮紫萁有效提取物，得到载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶。
1.2.2 抗拉伸强度的测定
室温下使用电子万能实验机对SA/CMCS水凝胶抗拉伸强度进行测试。将水凝胶制成10 mm×7 mm的矩形长条，置于电子万能实验机上测定抗拉伸强度，拉伸速度为500 mm/min。
1.2.3 SA/CMCS水凝胶制备条件的优化
1.2.3.1 单因素试验
以抗拉伸强度为指标，考察NaCl浓度（0.1%、0.5%、0.9%、1.3%、1.7%）、EDC/NHS添加量（1.5%、2.25%、3%、3.75%、4.5%）、m（SA）∶m（CMCS）=3:7、2:3、1:1、3:2、7:3，对SA/CMCS水凝胶抗拉伸强度的影响。
1.2.3.2 响应面试验
以抗拉伸强度为响应值，优化SA/CMCS水凝胶制备条件。基于单因素实验结果，选择每个相关变量的3个水平进行中心组合设计（Box-Behnken），以分析响应模式并建立模型。
1.2.4 傅里叶红外光谱测定（FT-IR）
室温下使用傅立叶变换红外光谱仪对干燥的水凝胶样品进行测试。以KBr作为背景，按质量比1 : 180的比例加入烘干的水凝胶和KBr混合研磨，磨匀后的粉末放入压片机，将压片后的样品进行测量。扫描范围400～4000 cm-1。
1.2.5 孔隙率测定
1.2.6 溶胀曲线的测定
1.2.7 体外药物累计释放测定
1.2.8 抑菌性测定
使用液体抑菌的方法测定水凝胶的抑菌率。选择大肠杆菌和金黄色葡萄球菌，采用细菌的吸光度（OD值）法研究水凝胶的抗菌性能。
1.2.9 抗炎性测定
使用Raw264.7小鼠巨噬细胞测定NO释放量，评价水凝胶的抗炎作用。
1.2.10 细胞存活率测定
使用Raw264.7小鼠巨噬细胞测定水凝胶细胞相容性。
2结果与讨论
2.1 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶制备的最优条件
2.1.1 单因素试验
SA与CMCS质量比、NaCl浓度、EDC/NHS添加量均可影响水凝胶的抗拉伸强度。
2.1.2 响应面回归模型的建立与分析
根据单因素试验的结果，设计响应面试验，因素水平见表1，响应面试验结果见表2。
2.2 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料的FT-IR分析
空白和载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料的FT-IR如图3所示。
2.3 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料的孔隙率分析
空白和载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料的孔隙率结果如图4所示。
2.4 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料的溶胀度分析
水凝胶溶胀度能反映出水凝胶的吸水能力和孔结构。水凝胶中亲水性官能团，如羟基、氨基和酰胺基团使水凝胶吸收大量的水，导致水凝胶膨胀。在溶胀期间，水凝胶的交联网络结构能够防止水凝胶完全被破坏[23]。SA/CMCS水凝胶的溶胀曲线结果如图5所示。
2.5 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料药物释放分析
载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料在PBS中的累计释放曲线如图6所示，0～10 h刺五加/桂皮紫萁提取物的释放量随着时间的增加而均匀增加，释放速度基本恒定，呈零级释药状态，在10 h时释放率为（79.3±1.7）%；随着释放时间的延长，提取物的释放速率降低，趋近于0，当24 h时，药物累计释放率达到（93.34±2.4）%。
2.6 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料抑菌、抗炎作用分析
空白和载刺五加/桂皮紫萁水凝胶敷料的抑菌作用评价如图7a和7b所示。
2.7 载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料生物相容性分析
在Raw264.7小鼠巨噬细胞上评价两种水凝胶敷料的生物相容性。
3结论
本文以水凝胶抗拉伸强度为响应值，优化出SA/CMCS水凝胶最佳制备条件为：NaCl浓度0.8%，EDC/NHS添加量2.25%，m（SA）∶m（CMCS）=1:1，此条件下水凝胶抗拉伸强度为0.884 MPa。在最佳条件下制备负载1%刺五加/桂皮紫萁提取物的水凝胶，FT-IR表明SA/CMCS水凝胶敷料已成功负载提取物，且未改变提取物的有效成分结构。SA/CMCS水凝胶敷料具有良好的吸收伤口组织液的作用，空白和载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶伤口敷料的溶胀度分别为（133±2.7）%和（135±3.6）%，孔隙率分别为（94.4±1.8）%和（90.5±1.2）%。载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料对提取物具有良好的缓释作用，对金黄色葡萄球菌、大肠杆菌和NO的释放均具有较好的抑制作用，且具有良好的生物相容性。本研究结果表明，载刺五加/桂皮紫萁SA/CMCS水凝胶敷料具有良好的机械强度、理化性能和抑菌抗炎功能，具有开发成为新型伤口敷料的潜力。
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