细胞无菌检测
无菌检测 sterility testing

----利用方法对细胞中细菌、真菌、支原体和病毒检验的过程。包括是否有污染及确定具体污染

一、一般要求
应根据细胞来源、潜在污染暴露史、细胞预期应用目的及所处环境等方面对细胞进行风险评估。考虑的因素包括但不限于以下几个方面:
a)应考虑细胞样本源。来自不同物种的细胞很可能携带潜在的微生物;
b) 应根据细胞的使用目的进行相关污染检测;
c)考虑细备和细胞培养的全周期所处的环境因素。根据暴露史评估可能的污染,如用于培养细胞的动物血清可能被特定的微生物污染。
依据风险评估判可能性最大的微生物污染类型,评估现有检验方法的话用性为待检测样本选择合适的方法。

二、方法选择
1.总体要求
在选择检测方法时,应了解该方法原理、微生物类型以及灵敏度等。
选择检测方法应依据预期目的、样本特性和处理因素。
选择的方法应经过验证或确认。

2.细菌和真菌
细菌是一大类普遍存在的单细胞微生物。细菌的直径通常只有几微米,其形状多样,如球状、杆状和螺旋状等。由于分布广泛、生长迅速和体积大小等特点,细菌以及酵母和霉菌是细胞培养中最常见的生物污染物。
细菌污染在培养物感染后几天内就很容易被肉眼观察到;受感染的培养物通常会变得浑浊,有时表面会有一层薄膜。经常还会出现培养基的pH值突然下降的情况。在低倍显微镜下,细菌以细小颗粒的形式出现在细胞之间,在高倍显微镜下观察可以分辨出单个细菌的形状。下面的模拟图像显示了贴壁培养的293细胞被大肠杆菌污染。
(1)依据需要选择适用干细菌和真菌的检测方法,如直接镜检法、膜过滤法、直接接种法、PCR法、MNP标记法、飞行时间质谱等。
(2)初步判断是否有细菌或真菌污染物,宜采用直接镜检法。
(3)若试验样品性质如可行,应首先选择膜过滤法进行检测。
(4)直接接种法对干细胞培养体系中添加抗生素的样品应考虑抗生素对细菌和直菌的抑制效应而影响检测的敏感性。
(5)利用PCR的方法检测细菌16SrRNA高保守区的序列来判断是否有细菌污染。利用PCR的方法检测细菌16SrRNA可变区的序列和MNP标记序列分析污染细菌的种属,利用MNPITS1或ITS2等序列判断感染真菌的种属。
(6)对微生物的组分进行检测可采用飞行时间质谱法等。

3.病毒
病毒是一种微小的感染性病原体,利用宿主细胞的结构进行繁殖。它们的体积极小, 难以在培养中被检测到,也难以从细胞培养实验室使用的试剂中去除。由于大多数 病毒对宿主有非常严格的要求,因此,它们通常不会对宿主以外物种的细胞培养物产生不良影响。但被病毒感染的细胞培养物会对实验室人员造成严重的健康威胁, 尤其是当实验室培养的是人类或灵长类的细胞时。要检测细胞培养物是否被病毒感染,可以使用电子显微镜观察、用抗体组合进行免疫染色、ELISA检测或是使用合适 的病毒引物进行PCR扩增。
(1)依据需要选择适用干病毒检测的方法,如直接镜检法、细胞形态观察及血吸附试验、体外不同细胞接种法、动物检查法、鸡胚接种检查法、PCR法、高通最测序法、基因片技术、荧光免疫法、酶联免疫法和血细胞凝集试验等方法。
(2)可利用光学显微镜观察病毒感染导致的细胞病变合胞体的形成:可通过电子显微镜观察大小和形态来识别病毒;可通过免疫电镜技术识别病毒。
(3)取细胞培养物的上清液或细胞培养物的裂解物,接种已知未污染病毒的相应细胞,检测是否出现细胞病变,或采用血细胞的吸附现象检测待检细胞培养物是否污染病毒。
(4)若采用动物检查法,可通过对普通动物或者含有特定病原体的动物,如小(包括乳鼠和成鼠)
豚鼠、仓鼠、家兔和非人灵长类动物等进行颅内、腹腔、鼻腔和皮下等部位接种,判断是否有病毒感染。
(5)分离黏液病毒、疱疹病毒和痘病毒宜采用鸡胚接种检查法。鸡胚应来自无特定病原(SPF)鸡群。
(6)采用PCR法检测病毒核酸高保守区的序列来判新是否有病毒污染。
(7)可采用高通量测序法鉴定病毒特异性序列。
(8)采用基因芯片技术检测病毒,需要合成与潜在污染的病毒基因组上的特定区域互补的核酸探针。
(9)用病毒抗原特异的抗体,通过荧光免疫反应用荧光显微镜检测细胞内病毒蛋白来判断特定的病毒污染。
(10)运用病毒抗原特异的抗体,通过酶联免疫反应检测细胞内或者上清液中的病毒蛋白来判断特定的病毒污染。
(11)通过凝集血细胞检测上清液中的病毒颗粒,如用鸡红细胞检测流感病毒。

4.支原体
支原体是无细胞壁的简单细菌,被认为是最小的自我复制生物。由于支原体非常小( 通常小于1 µm),因此很难被检测到,除非它们达到了极高的密度,导致细胞培养物变质;在此之前,通常没有明显的感染迹象。一些生长缓慢的支原体可在培养物中持续存活,而不会导致细胞死亡,但它们可以改变培养体系中宿主细胞的行为和代谢。
(1)依据需要选择适用于支原体检测的方法,如培养法、指示细胞培养DNA染色法、PCR法、荧光原位杂交法、腺苷磷酸化酶活性检测法等方法。
(2)若对支原体检测结果报告时间没有急切要求的,宜选择培养法进行检测。
(3)利用DNA热色法,经荧光显微镜下观察看到有附着在细胞表面的大小不等,不规则的荧光着色颗粒则表明存在支原体污染。
(4)通过PCR法检测支原体16SrRNA序列保守区特异性序列来判定是否存在支原体。
(5)利用带光原位杂交法检测支原体,需要设计与支原体rRNA的高度保守区域互补的蒙光探针。
(6)腺苷磷酸化酶活性检测法不适用于本身腺苷磷酸化酶活性高的细胞。

5.过程控制
样品
(1)应根据所选方法,确定足够量的供试样品。
(2)应根据供试样品可能的稳定性考虑其储存条件。
(3)应实行严格微生物规范操作,避免取样讨程中微生物污染。

试剂材料和仪器设备用具
(1)应考虑设备、试剂和耗材对微生物检测的影响。
(2)检测过程中应使用标准物质。
(3)应根据样品尺寸选择适宜的容器,避免蒸发、确保无微生物、无毒、无浸出。
(4)应配备与微生物检测能力和工作量相适应的仪器设备,其类型、测量范围和准确度应符合检测要求。
(5)检测所用试剂应贮存在适的环境中,以确保试剂的稳定性。
(6)用于微生物检测的溶液、稀释剂或冲洗剂以及所使用的耗材若是作为微生物检测测试样品的成分,则不应具有抗微生物活性的特性。

操作
(1)待测样品的收集操作应确保无污染引人。
(2)应依据微生物的最佳生长条件和营养需求选择专门的分离方法进行检测。
(3)应根据微生物的生长速度,以获得足够数量的生物体。
(4)应考虑某些微生物种类和真菌是否形成孢子。
(5)应考虑细胞培养过程中受支原体污染时,支原体可能黏附在细胞膜上仅以最低水平浓度存在于培养上清液中。
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【民房内的燃料黑窝点】甲醇燃料是一种液体燃料,具有易燃、有毒有害特性,其蒸发与空气混合后遇明火或者高温易引起爆炸,属于危险化学品。这种危险化学品,很多人避之不及,但是也有人却非法储存、运输,将其作为赚钱的门路。近日,西宁市湟源县公安局对湟源县首起非法经营生物燃料案决定移送检察机关审查起诉。

不久前,湟源县公安局西片区案件办理队接到湟源县应急管理局移交线索,称有人在湟源县申中乡某村非法储存生物燃油,接到线索后,西片区办案队民警立即对该线索核查。顺藤摸瓜,民警找到了存储生物燃料的地方,涉案人郭某在村子里租赁一间民房,民房内有多桶液体,经民警初步判断桶内应该为生物燃料。将液体取样后,经鉴定主要成分为甲醇,院内储存的液体量达600千克。

郭某储存这么多甲醇做什么? 经过调查得知,郭某从西宁某地一生产甲醇的公司购买大量甲醇,用车将甲醇运输到租住地,然后在租住地内给购买回来的甲醇兑入一定量的水,将水混合后,郭某又将甲醇拉到湟源县城售卖给一些餐馆,餐馆则用甲醇当做燃料,成本较低,因此郭某的甲醇十分畅销。

就这样,郭某从生产厂家购买成分较高的甲醇,然后回家兑水,再售卖给餐馆,以此来赚取一定差价从中获利。

为了核查线索,准确找到买方,办案民警发现郭某售卖的一些餐馆早已更名、转让,老板都已换了几茬,为及时固定证据,民警克服案发时间跨度大,调取大量的账单,一笔笔作核查,因涉案量大、金额大,湟源县公安局西区办案队及时申请湟源县人民检察院提前介入案件。

国家对危险化学品实行许可制度,未经许可任何企业和个人不得经营危险化学品。犯罪嫌疑人郭某未经许可经营法律、行政法规规定的专营、专卖物品或者其他限制买卖的物品,其行为已触犯《中华人民共和国刑法》第225条第1项之规定,涉嫌非法经营罪。经过长时间调查,查实郭某非法经营数额43万余元。

目前,此案已办结,移送湟源县人民检察院审查起诉。

警方提示:

湟源县公安局西区办案队负责人许宗杰告诉记者,此案中所谓的生物燃料甲醇,在日常生产、运输、使用中具有安全隐患,但当前绝大部分的商业用户对此毫不知情,不具备相应的安全使用技术标准。然而,由于燃料价格低廉,一些商户难抵诱惑,容易贪小便宜吃大亏。

危险化学品的生产、销售、运输等均需要具备相应资质、条件,经国家批准后方可从事。犯罪嫌疑人郭某未经国家准许,在自身不具备相应条件的情况下,擅自存储、运输、销售系危险化学品的甲醇燃料,严重危害社会生产经济秩序,其行为属于法律规制的非法经营行为,依法应予严惩。(图片由湟源县公安局提供 青海法治报·法眼记者 陈文雯)

#他山之石# 【借鉴他国增产经验,中国打响大豆产能提升“攻坚战”】参考消息网5月13日报道(文/王建)大豆是中国饮食中重要的植物蛋白和油料来源,豆粕是生猪、牛羊饲料的重要成分。作为大豆原产地,我国是目前世界上最大的大豆进口国。根据海关数据,2021年进口大豆占全国总需求的85.5%。大豆因为进口依赖度高,成为影响中国粮食安全的关键农产品之一。

今年中央一号文件提出,大力实施大豆和油料产能提升工程。目前,中国大豆迎来播种期,在大豆主产区,一场以增加大豆国内市场供给,减少对外依赖的大豆产能提升“攻坚战”打响。

中国大豆单产远逊美国巴西

中国曾是大豆净出口国,但是近年来大豆生产出现下滑,产需缺口扩大,大豆进口量逐年增加。最近几年,我国进口大豆数量一直居于高位。海关公布的数据显示,2016年以来,中国每年进口大豆数量均超过8000万吨;2020年,突破1亿吨。

近年来,随着人们生活水平的提高,对肉蛋奶的品质提出了更高要求,豆饼、豆粕等优质蛋白饲料在养殖业中的需求越来越大,大豆作为饲料的用途也越来越重要。专家表示,豆粕饲用需求是拉动大豆进口增加的主要因素之一。

海关数据显示,中国主要的大豆进口国是巴西、美国、阿根廷。巴西是全球最大的大豆出口商,并已连续多年都是中国从国际市场购买大豆的第一大渠道。以2021年为例,中国从巴西购买的大豆数量达到了5815.1万吨,占我国大豆进口总量的60.2%左右。美国则是我国进口大豆的第二大渠道。2021年,我国从美国购买的大豆数量约为3231.2万吨,约为我国大豆进口总量的33.5%。

中国大豆是非转基因大豆,相比美国、巴西的转基因大豆,中国大豆的单产比较低。2021年,我国大豆平均亩产130.2公斤,仅为世界平均单产的66%,不到美国、巴西单产的60%。

据黑龙江省大豆协会相关负责人介绍,巴西大豆是从9月份开始播种,到第二年的3月份开始收获。过去巴西大豆产量低,长期受到杂草和病虫害的困扰。为了改变这种状况,巴西大量推广转基因大豆品种。目前巴西种植大豆,主要分为三大环节——机械播种、机械喷除草剂、机械收获,不再像过去需要除草、防虫治病和抗旱,大大提高了大豆产量。巴西也因此成为世界上大豆出口大国和强国。

从美国大豆生产发展来看,在美国,大豆单产一直处于世界前列。美国的大豆主要集中分布于中西部大平原,其主产区位于内布拉斯加州。这里土壤肥沃,阳光充足,种植区域高度集中,因此便于机械作业,呈现区域化、规模化、机械化、生产高效化的特点。

近年来,中国每年进口大豆数量都超过国内消费量的80%,对外依存度很高。专家表示,在全球粮食安全受到普遍关注的背景下,作为全球最大的大豆进口国和消费国,中国增强农民种植大豆积极性,扩大大豆面积,提高大豆单产,从而提升大豆产能十分必要,有利于降低对外依存度,增加自给率,更好地保障国家粮食安全。

坚持“扩面积提单产”双轮驱动

5月的黑龙江,正是春播春种的好时节,大豆播种陆续展开。这几天,黑龙江省黑河市爱辉区嘉兴现代农机专业合作社开始播种大豆。“今年我们合作社经营耕地3.5万亩,计划种植大豆2.5万亩,比去年增加1.4万亩。”合作社理事长盖永峰说。

2020年,盖永峰曾获评黑龙江省“大豆生产大王”。他说,今年国家鼓励扩种大豆,加上大豆行情价格也好,农民种植大豆的积极性提高。今年这家合作社和珠海的一家豆制品企业签订了长期合同,建立两万亩大豆标准化示范基地。

黑龙江省是中国最大的优质大豆生产和供给基地,常年大豆种植面积占全国40%以上,商品率达80%以上。今年,黑龙江省把新增1000万亩大豆作为重要任务来抓。

作为传统大豆主产区,黑龙江省黑河市积极优化种植结构,加快落实扩种大豆任务,宣传大豆生产者补贴、耕地轮作试点补助等政策,将大豆种植面积落实到户到田。根据黑河市农业农村局初步调查,预计将种植大豆1534.4万亩,较上年增加279.4万亩,扩种大豆面积占全省扩种量的近三分之一。

在扩种大豆上,中国提出在东北地区开展粮豆轮作,引导东北地区扩种大豆,在黄淮海、西北、西南等适宜地区推广玉米大豆带状复合种植,开展盐碱地种植大豆示范,今年力争大豆种植面积稳定在1.4亿亩以上,确保豆制品等食用大豆产品国内自给。

大豆产能提升工程,要坚持“扩面积、提单产”双轮驱动。提高单产,良种是关键。近日,在黑龙江省农科院大豆研究所的实验室里,育种专家栾晓燕在遴选大豆品种。“今年我们单是开展大豆试验的新品种就有20多个。”栾晓燕说。

这几年,栾晓燕和团队一直奔波在田间和实验室,培育的“黑农84”实现了高产、优质、多抗等性状基因聚合技术上的重大突破,去年通过了国家品种审定。目前,这个品种已在黑龙江、吉林、内蒙古等地推广1000万亩以上。

记者从黑龙江省农业农村厅了解到,今年黑龙江省大力实施大豆产能提升工程,全省大豆种植面积力争达到6850万亩,比2021年增加1000万亩以上;力争总产量达到170亿斤,比2021年增加26亿斤以上。

加大育种攻关提升竞争力

记者调研发现,近年来我国科研人员加大攻关,选育出一批大豆新品种,在产量、品质、抗性等方面都有所提升,实现了品种数量和质量的双增长,但与大豆育种先进国家相比还有差距,科技创新不足是我国大豆生产落后于美洲大豆主产国的重要原因。

据大豆育种专家介绍,近十余年,我国加大大豆育种投入力度,大豆种业快速发展,但仍存在一些问题:分散重复和低水平竞争等问题未得到根本解决;重要性状基因发掘方面缺乏长期、系统、深入的研究;种质资源鉴定评价与开发利用滞后;对优异种质资源的挖掘利用不够,育成品种遗传基础狭窄。此外,我国大豆分布区域广,产业集中度低,种子企业经营效益差,尚未成为大豆种业科技创新的主体,育种工作主要由科研单位和高等院校承担,育种规模小,育种力量与资源分散,导致大豆品种遗传改良进度缓慢。

专家建议,未来要继续坚持大豆种业科技自立自强,提升竞争力。

除了加强育种能力外,在扩种大豆方面,农民也有一定担心。与种植玉米相比,大豆抵御自然灾害能力弱,市场风险大;大豆单产低,比较收益低。一些农民反映,大豆开花期如果遭遇持续干旱天气,可能导致大豆大幅减产。

美国农业的高度发展与政府推行的覆盖面广泛的农业保险密不可分。在美国,保险覆盖的常见作物就包括大豆。去掉食物补贴,美国农业支出中占最大头的是农作物保险。农业灾害损失具有面积广、数额巨大的特点,私营公司难以单独承担农业保险的巨大风险。美国联邦作物保险计划由政府负责整体监管,由保险公司负责实施、销售和维护保单,农民根据自身风险管理需求自愿参与,目前该保险计划已覆盖美国70%以上的农作物面积。

基层农业干部和农民期盼,发挥市场机制提升大豆防范市场风险的能力。黑龙江省农业农村厅相关负责人建议,在黑龙江开展大豆完全成本保险或种植收入保险试点,逐步实现产粮大县全覆盖,推动农业保险由“保成本”向“保价格、保收入”转变,切实防范自然灾害和市场变动双重风险,保障农户收入。


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