#肖战[超话]#
少数拥有大智慧的人拥有自我启迪，自省自觉的能力。这就是我们戏称的觉醒，不与低维度的人、事、物纠缠，因为他的目标不在此而在彼。
@X玖少年团肖战DAYTOY
肖战一路走来所遇之事，使他走出了认知局限，超越了自己的认知维度，开启了高维智慧。
#肖战肖春生# xz #肖战时影#
肖战肖春生xfx肖战时影
cr：肖战工作室
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【“免税龙头”拿下2022香港最大IPO】
时隔一个月，“免税店一哥”取代“锂王”，成为今年香港最大IPO。
中国旅游集团中免股份有限公司（下称“中国中免”）于8月19日确定了赴港二次上市，发行价为158港元/股，共计发行1.03亿股普通股，公司将于8月25日正式在港交所上市交易。
中国中免有望成为2022年港股规模最大的一场IPO。按发行价计算，中免此次赴港上市募资金额将达162.74亿港元，这将打破7月份由天齐锂业创造的134亿港元融资纪录。
为保证这场最大规模IPO顺利进行，中国中免引入9名基石投资者。当中不乏韩国知名化妆品集团爱茉莉（认购7.85亿港元）、泸州老窖（认购6.22亿港元）等消费行业头部企业，以及大型央企、基金企业等，合计认购62.38亿港元的发售股份。
在赴港股二次上市之前，中国中免已是A股市场一支千亿“白马股”。在2020年短短一年时间里，中国中免股价不断创新高，翻了近四倍，市值一度飙升至7800亿。
但在之后的仓位轮动中，中国中免也体验了一波“极限捧杀”。如今，中国中免的总市值约3671亿元，与高位相比，蒸发了近4000亿。
全球第一免税，三年入账1683亿
中国中免成立于1984年，是全球最大旅游零售运营商。
公司经历过一次“弃旅从商”的改名，之前叫中国国旅，业务涵盖了旅行社+免税业务。2020年6月，在海南离岛免税政策不断利好下，公司决定剥离旅行社业务，all in免税业务并改名中国中免。目前公司免税业务主要包括烟酒、香化等免税商品的批发、零售。
由于受到特许经营政策的影响，我国的免税行业竞争格局清晰。目前，国内只有8家企业拥有经营免税业务的资格，分别是中免、深免、珠免、中出服、中侨、王府井、海旅投和海发控。
中免是中国免税行业的绝对龙头。手握3块免税牌照，是这8家中持有免税牌照最多的企业。背后的控购股东是国资委全资控股的中国旅游集团，持股53.3%。
近两年，国人境外消费回流，呈现出了强大的奢侈品购买力。2020 年全球奢侈品市场因疫情大幅萎缩，但中国境内奢侈品消费却逆势增长 48%。
中国中免也顺势被中高端消费者捧上全球免税第一的宝座。招股书显示，按照销售收入计算，中国中免的全球排名在过去10年里不断提升，已于2020年及2021年位列全球第一。
2021年，中国中免占全球旅游零售行业市场份额的24.6%，并拥有全国最多的免税店，在国内免税市场份额达86%，超过第二位企业20倍。
在上海从事金融工作的Dunn表示，手里的钱投到哪里都不踏实，还不如到海南包个游艇，度个假，免税店购购物，买点奢侈品都能保值。
许是像Dunn一样中高端消费者不在少数，中国中免在过去三年业绩逆势增长。
招股书显示，2019年至2021年，中国中免的营业收入分别为480.13亿元、525.98亿元及676.76亿元；净利润分别为54.71亿元、71.09亿元及124.41亿元。收入复合年增长率达18.7%，净利润复合年增长率达50.8%。
具体来看，中免的业绩增长，主要源于海南离岛业务、线上及有税商品的销售。
首先，离岛免税政策是指对乘飞机、火车、轮船离岛旅客实行部分限免进口税的优惠政策。
海南是继日本冲绳岛、韩国济州岛和马祖、金门之后，全球第4个实施离岛免税政策的区域。近年来，海南离岛免税政策不断利好，岛旅客每年每人免税额度从3万元提升至10万元，不限次数，且取消单件商品8000元免税限额规定；再来，离岛免税商品品种由38种增至45种，其中新增加了手机、平板电脑等电子消费产品以及酒类、茶叶等。
这让海南也一跃成为全国最热门的旅游目的地之一。弗若斯特沙利文数据显示，2021中国离岛免税商品销售市场规模达到452亿元，2019-2021年复合增长率达83%。
从上海跑到三亚度假的Dunn戏谑道，“走在三亚的大马路上几乎看不到人，人全挤在免税店。”
这话一点也不夸张。仅海南的5家离岛免税店就给中国中免贡献了七成收入。
2021年，单是海南的5家离岛免税店，就为中免贡献了69.5% 的收入。要知道，中免旗下免税店数量近200家，但63%的门店依然处于暂时关闭状态，只有26%的门店恢复了正常运营，11%的门店恢复运营但减少了容量。
所以，海南的离岛业务已成为中免最大的营收支柱。
跨界玩电商，线上收入已是免税品3倍
除了离岛业务，线上销售和有税商品销售也逐渐成为中免瞄准的新方向。
多数人可能以为购买免税品，需要凭机票、出入境记录或者飞到海南才行。事实上，免税品早已不再是线下购物专属。
中国中免早在2020年就已推出线上销售渠道，而且大部分商品不需要机票就可以直邮到家，俨然是一副跨境电商的模样。
官网显示，中免“cdf会员购”小程序于2020年11月正式上线。据悉，上海、海南、北京免税店的商品都可以在小程序直接买到。目前，其会员数已超过2200万，2022年目标是2600万。
自2020年2月起，中国中免缴纳了滞销库存免税品关税，并通过线上渠道销售。翻译一下就是，中免“自掏腰包”把免税品的关税给交上了，消费者可以放心购买“滞销的免税品”。
不过，这也让中国中免的毛利率明显下降。招股书显示，2019-2021年，中国中免的毛利率分別为51.1%、38.9%和32.9%。主要原因是销售成本增加，其中就包括有税商品支付的关税、消费税、其他相关税项增加以及使用折扣和促销。
近年来，中免的有税商品销售收入占比大幅上升。招股书显示，2019年至2022第一季度，有税商品收入占比分别为2.4%、37.5%、35.5%以及31.3%。其中，绝大部分来自香化商品，如香水、彩妆、护肤品等。
而且主要是通过线上销售实现的。招股书显示，2021年，中免线上销售收入为318.64亿元，占2021年总收入的47%；其中，有税线上销售收入为235.81亿元，免税线上销售收入为82.83亿元。
因此，中免已经不局限于免税品，开始去抢跨境电商的“饭碗”。
虽说中免涉水“电商”不久，但在上游供应链方面具备天然优势，全球绝大多数顶级奢侈品牌都是中免的供应商，光靠“正品+免税”这两个字眼，中免就足以“降维打击”一众奢侈品电商了。
奢侈品电商们的日子从2020开始就不太好过。先是呼哈网、网易尚品、品聚网、尚品网、尊酷网相继关闭。后有“奢侈品电商第一股”司库开始由盈转亏，最近司库的破产消息更是“越传越真”，几度霸占热搜。
一旦寺库退市破产，将意味着国内奢侈品电商平台 " 全军覆没 "。京东创始人刘强东曾说：" 垂直电商，不是它的平台有价值，而是品牌有价值，所以只有垂直品牌可以存活。"
目前，像天猫、京东等大型综合电商平台都在发力奢侈品品牌，品牌方也乐于跟头部渠道合作。这就造成了垂直电商生存空间不断被挤压，不是被并购、就是申请破产，能活下来的垂直电商已经所剩无几。
免税牌照松动，蝴蝶效应引行业联动
中免之所以拓展入局“跨境电商”，另一原因是近年免税市场的格局稍有松动，不少公司开始惦记在免税市场上“分一杯羹”。
原本免税牌照具有稀缺性，获取难度很大。长期以来，国内只有中免、日上免税行、海免、珠免、深免、中出服、中侨等七家企业拥有免税业牌照。
但为了拉动国内消费，免税牌照的发放开始松动。2020年6月，我国第八张免税牌照被王府井拿下。此消息一出瞬间引起热议，免税市场也由此划开了一个口子。
随后，国内掀起了一阵免税牌照的申报热。据不完全统计，2020年7月，已经有百联股份、岭南控股、大商股份、欧亚集团、南宁百货、步步高、友阿股份、中百集团等A股上市公司，向政府相关部门提出了免税品经营资质的申请。
“免税店最大的好处，便是它所带有的蝴蝶效应。”中国商业经济学会副会长宋向清曾指出。免税店的建设，除了直接带动消费，还可以带动城市旅游、物流快递、航空业、交通运输、包装等多行业联动发展，可以刺激内需扩大消费、形成国内国际双循环。
相比于海外成熟的免税市场，我国免税市场仍处于发展阶段。目前，韩国免税市场拥有超1400亿人民币规模，占全球份额的20%以上，其中，近七成市场是由中国人贡献的。而我国的免税市场只有百亿规模，占比全球份额不到10%。
海外免税运营商拥有较为成熟的市场布局。比如，瑞士的Dufry、韩国的新罗，从事免税业务分别有69年、35年之久，均拥有超过1000家合作品牌商。再加上成熟的供应链系统，也让他们的免税品议价更有竞争力。
瑞银证券中国区休闲行业主管陈欣在接受媒体采访时曾表示：“免税在中国是特许经营的行业。政府发展免税业务，是为了吸引国人海外消费回流，中国免税企业的竞争对手是海外的免税运营商。”
疫情后，全球免税巨头逐渐恢复，他们无一不觊觎着潜力巨大的中国市场。新罗网上免税店的300多种化妆品和保健食品，于今年7月中旬登陆中国购物网站；Dufry也宣布将与阿里巴巴组建中国合资公司，推进国内的旅游零售业务。
海外免税巨头的进入，一定程度上会对中免的地位造成威胁。这或许也是中免冲刺港股的源动力之一。（投中网）
时隔一个月，“免税店一哥”取代“锂王”，成为今年香港最大IPO。
中国旅游集团中免股份有限公司（下称“中国中免”）于8月19日确定了赴港二次上市，发行价为158港元/股，共计发行1.03亿股普通股，公司将于8月25日正式在港交所上市交易。
中国中免有望成为2022年港股规模最大的一场IPO。按发行价计算，中免此次赴港上市募资金额将达162.74亿港元，这将打破7月份由天齐锂业创造的134亿港元融资纪录。
为保证这场最大规模IPO顺利进行，中国中免引入9名基石投资者。当中不乏韩国知名化妆品集团爱茉莉（认购7.85亿港元）、泸州老窖（认购6.22亿港元）等消费行业头部企业，以及大型央企、基金企业等，合计认购62.38亿港元的发售股份。
在赴港股二次上市之前，中国中免已是A股市场一支千亿“白马股”。在2020年短短一年时间里，中国中免股价不断创新高，翻了近四倍，市值一度飙升至7800亿。
但在之后的仓位轮动中，中国中免也体验了一波“极限捧杀”。如今，中国中免的总市值约3671亿元，与高位相比，蒸发了近4000亿。
全球第一免税，三年入账1683亿
中国中免成立于1984年，是全球最大旅游零售运营商。
公司经历过一次“弃旅从商”的改名，之前叫中国国旅，业务涵盖了旅行社+免税业务。2020年6月，在海南离岛免税政策不断利好下，公司决定剥离旅行社业务，all in免税业务并改名中国中免。目前公司免税业务主要包括烟酒、香化等免税商品的批发、零售。
由于受到特许经营政策的影响，我国的免税行业竞争格局清晰。目前，国内只有8家企业拥有经营免税业务的资格，分别是中免、深免、珠免、中出服、中侨、王府井、海旅投和海发控。
中免是中国免税行业的绝对龙头。手握3块免税牌照，是这8家中持有免税牌照最多的企业。背后的控购股东是国资委全资控股的中国旅游集团，持股53.3%。
近两年，国人境外消费回流，呈现出了强大的奢侈品购买力。2020 年全球奢侈品市场因疫情大幅萎缩，但中国境内奢侈品消费却逆势增长 48%。
中国中免也顺势被中高端消费者捧上全球免税第一的宝座。招股书显示，按照销售收入计算，中国中免的全球排名在过去10年里不断提升，已于2020年及2021年位列全球第一。
2021年，中国中免占全球旅游零售行业市场份额的24.6%，并拥有全国最多的免税店，在国内免税市场份额达86%，超过第二位企业20倍。
在上海从事金融工作的Dunn表示，手里的钱投到哪里都不踏实，还不如到海南包个游艇，度个假，免税店购购物，买点奢侈品都能保值。
许是像Dunn一样中高端消费者不在少数，中国中免在过去三年业绩逆势增长。
招股书显示，2019年至2021年，中国中免的营业收入分别为480.13亿元、525.98亿元及676.76亿元；净利润分别为54.71亿元、71.09亿元及124.41亿元。收入复合年增长率达18.7%，净利润复合年增长率达50.8%。
具体来看，中免的业绩增长，主要源于海南离岛业务、线上及有税商品的销售。
首先，离岛免税政策是指对乘飞机、火车、轮船离岛旅客实行部分限免进口税的优惠政策。
海南是继日本冲绳岛、韩国济州岛和马祖、金门之后，全球第4个实施离岛免税政策的区域。近年来，海南离岛免税政策不断利好，岛旅客每年每人免税额度从3万元提升至10万元，不限次数，且取消单件商品8000元免税限额规定；再来，离岛免税商品品种由38种增至45种，其中新增加了手机、平板电脑等电子消费产品以及酒类、茶叶等。
这让海南也一跃成为全国最热门的旅游目的地之一。弗若斯特沙利文数据显示，2021中国离岛免税商品销售市场规模达到452亿元，2019-2021年复合增长率达83%。
从上海跑到三亚度假的Dunn戏谑道，“走在三亚的大马路上几乎看不到人，人全挤在免税店。”
这话一点也不夸张。仅海南的5家离岛免税店就给中国中免贡献了七成收入。
2021年，单是海南的5家离岛免税店，就为中免贡献了69.5% 的收入。要知道，中免旗下免税店数量近200家，但63%的门店依然处于暂时关闭状态，只有26%的门店恢复了正常运营，11%的门店恢复运营但减少了容量。
所以，海南的离岛业务已成为中免最大的营收支柱。
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近年来，中免的有税商品销售收入占比大幅上升。招股书显示，2019年至2022第一季度，有税商品收入占比分别为2.4%、37.5%、35.5%以及31.3%。其中，绝大部分来自香化商品，如香水、彩妆、护肤品等。
而且主要是通过线上销售实现的。招股书显示，2021年，中免线上销售收入为318.64亿元，占2021年总收入的47%；其中，有税线上销售收入为235.81亿元，免税线上销售收入为82.83亿元。
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奢侈品电商们的日子从2020开始就不太好过。先是呼哈网、网易尚品、品聚网、尚品网、尊酷网相继关闭。后有“奢侈品电商第一股”司库开始由盈转亏，最近司库的破产消息更是“越传越真”，几度霸占热搜。
一旦寺库退市破产，将意味着国内奢侈品电商平台 " 全军覆没 "。京东创始人刘强东曾说：" 垂直电商，不是它的平台有价值，而是品牌有价值，所以只有垂直品牌可以存活。"
目前，像天猫、京东等大型综合电商平台都在发力奢侈品品牌，品牌方也乐于跟头部渠道合作。这就造成了垂直电商生存空间不断被挤压，不是被并购、就是申请破产，能活下来的垂直电商已经所剩无几。
免税牌照松动，蝴蝶效应引行业联动
中免之所以拓展入局“跨境电商”，另一原因是近年免税市场的格局稍有松动，不少公司开始惦记在免税市场上“分一杯羹”。
原本免税牌照具有稀缺性，获取难度很大。长期以来，国内只有中免、日上免税行、海免、珠免、深免、中出服、中侨等七家企业拥有免税业牌照。
但为了拉动国内消费，免税牌照的发放开始松动。2020年6月，我国第八张免税牌照被王府井拿下。此消息一出瞬间引起热议，免税市场也由此划开了一个口子。
随后，国内掀起了一阵免税牌照的申报热。据不完全统计，2020年7月，已经有百联股份、岭南控股、大商股份、欧亚集团、南宁百货、步步高、友阿股份、中百集团等A股上市公司，向政府相关部门提出了免税品经营资质的申请。
“免税店最大的好处，便是它所带有的蝴蝶效应。”中国商业经济学会副会长宋向清曾指出。免税店的建设，除了直接带动消费，还可以带动城市旅游、物流快递、航空业、交通运输、包装等多行业联动发展，可以刺激内需扩大消费、形成国内国际双循环。
相比于海外成熟的免税市场，我国免税市场仍处于发展阶段。目前，韩国免税市场拥有超1400亿人民币规模，占全球份额的20%以上，其中，近七成市场是由中国人贡献的。而我国的免税市场只有百亿规模，占比全球份额不到10%。
海外免税运营商拥有较为成熟的市场布局。比如，瑞士的Dufry、韩国的新罗，从事免税业务分别有69年、35年之久，均拥有超过1000家合作品牌商。再加上成熟的供应链系统，也让他们的免税品议价更有竞争力。
瑞银证券中国区休闲行业主管陈欣在接受媒体采访时曾表示：“免税在中国是特许经营的行业。政府发展免税业务，是为了吸引国人海外消费回流，中国免税企业的竞争对手是海外的免税运营商。”
疫情后，全球免税巨头逐渐恢复，他们无一不觊觎着潜力巨大的中国市场。新罗网上免税店的300多种化妆品和保健食品，于今年7月中旬登陆中国购物网站；Dufry也宣布将与阿里巴巴组建中国合资公司，推进国内的旅游零售业务。
海外免税巨头的进入，一定程度上会对中免的地位造成威胁。这或许也是中免冲刺港股的源动力之一。（投中网）
【科学家成功实现活细胞转录组测序】中国科学报：在我们呱呱坠地之前，受精卵是如何发育成复杂个体的？为何正常的细胞会慢慢变成癌细胞？
细胞是生命的基本单位，了解它的过去、现在和未来不仅有助于我们了解正常发育的过程，也对理解疾病的产生和发展至关重要。然而，想要“看清”细胞的“前世今生”仍然存在显著的技术困难。
8月17日，现任中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所研究员（原瑞士洛桑联邦理工学院博士后）陈万泽以共同第一作者身份在国际顶级期刊Nature上发表长文，介绍了研究团队在国际首创的活细胞转录组测序技术（Live-seq），该技术首次让单细胞进行转录测序后，依然能保持细胞存活，首次实现了活细胞全基因表达的连续观测。
“该研究实现了使用Live-seq技术对同一个活细胞多次分离部分细胞质进行多次转录组测序的可行性，表明这一技术有望在将来用于构建单个活细胞的转录组系列变化动态。该研究为单细胞转录组测序提供了全新的研究策略，为我们理解生命过程的动态变化提供了强有力的手段，是这一领域的又一重大突破。” 北京大学生命科学学院教授汤富酬评论道。
不杀死细胞就能测序
人类体内的细胞拥有几乎一样的基因组，但是为什么能够产生多种多样的细胞？基因组中数万个的基因表达与否和高低，很大程度上决定了细胞的种类和功能，比如神经细胞、免疫细胞、各种肿瘤细胞等等。
因此，如果知道细胞不同时间的基因表达的变化，就能够了解细胞的过去、现在和未来。
当前，单细胞转录组测序技术是了解细胞状态的重要手段，就像看一张“高清照片”，通过单细胞测序能够看清细胞现在所有基因的表达状态。但是这些技术在理解细胞状态“电影”般的动态变化上却有很大的挑战。
“利用单细胞转录组测序技术来观测细胞状态的前提，是需要将细胞裂解，提取其中的RNA来测定每个基因表达量的高低，但这样就不能避免地杀死了细胞。”陈万泽说道，“使用单细胞测序技术，也只能了解到一个细胞当下的状态，却不能获得它的过去，也无法知晓它将来的功能。”
通过近七年的努力，陈万泽与合作者开发了活细胞转录组测序技术Live-seq，其核心是通过对活细胞中的部分细胞质进行微创提取，并对极其微量的细胞质RNA进行扩增，实现在进行单细胞转录组测序后，依旧保持细胞的存活和功能，从而可以跟踪细胞的动态变化。
论文通讯作者、瑞士洛桑联邦理工学院教授Bart Deplancke表示，该技术兼具全基因表达分辨率和动态解析能力，是目前对单细胞转录组直接动态测量、偶联细胞现有状态和其后续表型的唯一解决方案。
两次碰壁，终于“钓”出RNA
如何在不杀死细胞的前提下，看到细胞的动态变化？
“我们首先想到的是外泌体，它是细胞向外面吐出来的小泡，里面有蛋白、RNA等物质。如果我们把单个细胞的外泌体都收集起来，再对其中的RNA进行测量，或许就可以在一定程度上反映细胞状态而又不杀死细胞。”陈万泽说道。
单个细胞中仅有10 pg（皮克）的RNA，这相当于一克的一千亿分之一的重量，而细胞分泌的外泌体中的RNA更是少之又少。研究团队设计了微流控芯片来完成单细胞捕获、外泌体收集等过程，发现由于外泌体中的RNA数量太少，根本无法实现单细胞分子水平的观测。
随后，陈万泽尝试利用在生命科学领域非常小众的原子力显微镜，它有一个很尖的硅探针，多用来检测物质表面性质。研究团队通过对探针进行表面活化、修饰、洗脱等改造后，让其能够把细胞中的RNA“钓”出来。
“这种探针很细，对细胞的损伤很小，就像‘鱼钩’一样，改造后可以把细胞中的RNA‘钓’出来，又能保证细胞继续存活。我们改造了数十个探针后，结果只在两个细胞上成功“钓”到了基因。”陈万泽回忆道，当时购买一个原子力显微镜探针需要800美元，研究成本太高，成功率太低，让这项研究再次面临阻碍。
瑞士洛桑联邦理工学院学科交叉氛围浓厚，在一次偶然的学术交流中，陈万泽与导师了解到，瑞士苏黎世联邦理工学院的Julia Vorholt实验室开发了一种特殊的原子力显微镜，能够吸出一部分的细胞质。
一番交流后，两个课题组一拍即合，展开了联合攻关。联合团队对一系列的实验过程进行了优化，包括解决了RNA降解、低温下的快速操作、超微量样品转移、采样通道清洗避免交叉污染、图像下追踪细胞等多种问题，以保证实验结果的可靠性。
联合团队利用重新改造后的Live-seq，对五种类型共295个细胞进行了测序，发现Live-seq能够有效区分不同类型的细胞，且平均每个细胞能检测到约4112个基因的表达信息。
仅对少量的细胞质进行测序，是否就能代表细胞的状态？
“我们平行比较了单细胞测序结果，发现活细胞测序结果与普通的单细胞测序结果高度吻合，证明Live-seq能够很好地体现细胞的全转录组状态。”陈万泽说道。
细胞的存活率又如何保证呢？
“原子力探针尖端只有几百个纳米大小，而且能和细胞膜密封，对细胞损伤极小。吸取约5%至50%的细胞质后，细胞体积可以快速恢复到正常水平，存活率在85%至89%之间，细胞能进行正常分裂。通过一系列的功能分析和分子表征，我们没有发现Live-seq对细胞的状态有显著的影响。”陈万泽表示。
对此，审稿人在评审意见中也写道：“由于细胞测序后仍旧存活，Live-seq首次实现对同一个细胞全基因表达的连续测量。”
细胞测序史从“高清图片”到“高清电影”的跨越
在细胞观测技术史上，显微成像和基因编辑介导的分子记录等技术不仅能观察细胞水平的生长、分裂、死亡等过程，还能观测细胞中的单个或几个基因指标。
2009年，单细胞转录组测序技术为更系统全面地定义细胞类型和状态提供了变革性手段。但人们仍然只能观察到细胞的静态状态，无法连续观测细胞的动态或者检查细胞后续的表型。
如果将利用单细胞转录组测序技术观测细胞比喻为看一张细胞在分子水平的高清图片，那么利用Live-seq观测细胞，就好比看一部高清电影，能够看见细胞的“前世今生”。
“Live-seq可以回答细胞怎样的过去决定了它的现在，不只知道细胞中为何存在差异，还知道这些差异从何而来。”陈万泽介绍道。
在验证实验中，研究团队利用Live-seq直接测定了同一个巨噬细胞在不同时间的状态变化，发现细胞起始状态的少数基因的表达差异和噪音（如Nfkbia、Gsn等）是决定细胞后续反应差异的重要原因。对应地，普通的单细胞转录组无法找到这些规律。
陈万泽表示，尽管Live-seq仍然存在诸多挑战，需要进一步完善，比如低通量、暂不能在体内应用、在高度极化且mRNA分布不均的细胞中无法实现全细胞转录组测序、对细胞更多次的采样还需进一步研究等，但该技术首次实现了活细胞连续观测，也为单细胞测序技术发展带来了更多可能性。未来，团队将进一步进行深入研究，提高Live-seq技术的可用性。
细胞是生命的基本单位，了解它的过去、现在和未来不仅有助于我们了解正常发育的过程，也对理解疾病的产生和发展至关重要。然而，想要“看清”细胞的“前世今生”仍然存在显著的技术困难。
8月17日，现任中国科学院深圳先进技术研究院合成生物学研究所研究员（原瑞士洛桑联邦理工学院博士后）陈万泽以共同第一作者身份在国际顶级期刊Nature上发表长文，介绍了研究团队在国际首创的活细胞转录组测序技术（Live-seq），该技术首次让单细胞进行转录测序后，依然能保持细胞存活，首次实现了活细胞全基因表达的连续观测。
“该研究实现了使用Live-seq技术对同一个活细胞多次分离部分细胞质进行多次转录组测序的可行性，表明这一技术有望在将来用于构建单个活细胞的转录组系列变化动态。该研究为单细胞转录组测序提供了全新的研究策略，为我们理解生命过程的动态变化提供了强有力的手段，是这一领域的又一重大突破。” 北京大学生命科学学院教授汤富酬评论道。
不杀死细胞就能测序
人类体内的细胞拥有几乎一样的基因组，但是为什么能够产生多种多样的细胞？基因组中数万个的基因表达与否和高低，很大程度上决定了细胞的种类和功能，比如神经细胞、免疫细胞、各种肿瘤细胞等等。
因此，如果知道细胞不同时间的基因表达的变化，就能够了解细胞的过去、现在和未来。
当前，单细胞转录组测序技术是了解细胞状态的重要手段，就像看一张“高清照片”，通过单细胞测序能够看清细胞现在所有基因的表达状态。但是这些技术在理解细胞状态“电影”般的动态变化上却有很大的挑战。
“利用单细胞转录组测序技术来观测细胞状态的前提，是需要将细胞裂解，提取其中的RNA来测定每个基因表达量的高低，但这样就不能避免地杀死了细胞。”陈万泽说道，“使用单细胞测序技术，也只能了解到一个细胞当下的状态，却不能获得它的过去，也无法知晓它将来的功能。”
通过近七年的努力，陈万泽与合作者开发了活细胞转录组测序技术Live-seq，其核心是通过对活细胞中的部分细胞质进行微创提取，并对极其微量的细胞质RNA进行扩增，实现在进行单细胞转录组测序后，依旧保持细胞的存活和功能，从而可以跟踪细胞的动态变化。
论文通讯作者、瑞士洛桑联邦理工学院教授Bart Deplancke表示，该技术兼具全基因表达分辨率和动态解析能力，是目前对单细胞转录组直接动态测量、偶联细胞现有状态和其后续表型的唯一解决方案。
两次碰壁，终于“钓”出RNA
如何在不杀死细胞的前提下，看到细胞的动态变化？
“我们首先想到的是外泌体，它是细胞向外面吐出来的小泡，里面有蛋白、RNA等物质。如果我们把单个细胞的外泌体都收集起来，再对其中的RNA进行测量，或许就可以在一定程度上反映细胞状态而又不杀死细胞。”陈万泽说道。
单个细胞中仅有10 pg（皮克）的RNA，这相当于一克的一千亿分之一的重量，而细胞分泌的外泌体中的RNA更是少之又少。研究团队设计了微流控芯片来完成单细胞捕获、外泌体收集等过程，发现由于外泌体中的RNA数量太少，根本无法实现单细胞分子水平的观测。
随后，陈万泽尝试利用在生命科学领域非常小众的原子力显微镜，它有一个很尖的硅探针，多用来检测物质表面性质。研究团队通过对探针进行表面活化、修饰、洗脱等改造后，让其能够把细胞中的RNA“钓”出来。
“这种探针很细，对细胞的损伤很小，就像‘鱼钩’一样，改造后可以把细胞中的RNA‘钓’出来，又能保证细胞继续存活。我们改造了数十个探针后，结果只在两个细胞上成功“钓”到了基因。”陈万泽回忆道，当时购买一个原子力显微镜探针需要800美元，研究成本太高，成功率太低，让这项研究再次面临阻碍。
瑞士洛桑联邦理工学院学科交叉氛围浓厚，在一次偶然的学术交流中，陈万泽与导师了解到，瑞士苏黎世联邦理工学院的Julia Vorholt实验室开发了一种特殊的原子力显微镜，能够吸出一部分的细胞质。
一番交流后，两个课题组一拍即合，展开了联合攻关。联合团队对一系列的实验过程进行了优化，包括解决了RNA降解、低温下的快速操作、超微量样品转移、采样通道清洗避免交叉污染、图像下追踪细胞等多种问题，以保证实验结果的可靠性。
联合团队利用重新改造后的Live-seq，对五种类型共295个细胞进行了测序，发现Live-seq能够有效区分不同类型的细胞，且平均每个细胞能检测到约4112个基因的表达信息。
仅对少量的细胞质进行测序，是否就能代表细胞的状态？
“我们平行比较了单细胞测序结果，发现活细胞测序结果与普通的单细胞测序结果高度吻合，证明Live-seq能够很好地体现细胞的全转录组状态。”陈万泽说道。
细胞的存活率又如何保证呢？
“原子力探针尖端只有几百个纳米大小，而且能和细胞膜密封，对细胞损伤极小。吸取约5%至50%的细胞质后，细胞体积可以快速恢复到正常水平，存活率在85%至89%之间，细胞能进行正常分裂。通过一系列的功能分析和分子表征，我们没有发现Live-seq对细胞的状态有显著的影响。”陈万泽表示。
对此，审稿人在评审意见中也写道：“由于细胞测序后仍旧存活，Live-seq首次实现对同一个细胞全基因表达的连续测量。”
细胞测序史从“高清图片”到“高清电影”的跨越
在细胞观测技术史上，显微成像和基因编辑介导的分子记录等技术不仅能观察细胞水平的生长、分裂、死亡等过程，还能观测细胞中的单个或几个基因指标。
2009年，单细胞转录组测序技术为更系统全面地定义细胞类型和状态提供了变革性手段。但人们仍然只能观察到细胞的静态状态，无法连续观测细胞的动态或者检查细胞后续的表型。
如果将利用单细胞转录组测序技术观测细胞比喻为看一张细胞在分子水平的高清图片，那么利用Live-seq观测细胞，就好比看一部高清电影，能够看见细胞的“前世今生”。
“Live-seq可以回答细胞怎样的过去决定了它的现在，不只知道细胞中为何存在差异，还知道这些差异从何而来。”陈万泽介绍道。
在验证实验中，研究团队利用Live-seq直接测定了同一个巨噬细胞在不同时间的状态变化，发现细胞起始状态的少数基因的表达差异和噪音（如Nfkbia、Gsn等）是决定细胞后续反应差异的重要原因。对应地，普通的单细胞转录组无法找到这些规律。
陈万泽表示，尽管Live-seq仍然存在诸多挑战，需要进一步完善，比如低通量、暂不能在体内应用、在高度极化且mRNA分布不均的细胞中无法实现全细胞转录组测序、对细胞更多次的采样还需进一步研究等，但该技术首次实现了活细胞连续观测，也为单细胞测序技术发展带来了更多可能性。未来，团队将进一步进行深入研究，提高Live-seq技术的可用性。
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