【方案参考 | 微生物蛋白纯化实验室搭建模版】

一级学科:生物学

二级学科:生物化学、微生物学

简述:方案包含重组载体构建、蛋白纯化、蛋白性质分析等3大部分3个流程,涉及21种设备。

核心设备:高压破碎仪、蛋白纯化仪、高速冷冻离心机、紫外可见分光光度计、高效液相色谱

关键词:重组载体构建、蛋白纯化、亲和层析、疏水层析、离子交换层析、尺寸排阻层析、生理生化性质鉴定。

基本概念:重组载体构建、蛋白纯化、亲和层析、疏水层析、离子交换层析、尺寸排阻层析、蛋白性质分析。

实验流程:

蛋白纯化主要包括三个步骤:1)重组载体的构建;2)蛋白的上柱纯化;3)蛋白性质分析。

1、重组载体的构建

蛋白纯化主要分为异源表达纯化和野生菌纯化。其中异源表达纯化在蛋白上柱纯化之前需要构建目的基因的重组载体,并且在载体构建过程中给目的基因添加特殊的标签,如His-Tag、GST、Strep等,最终通过相应的亲和层析柱获得目的蛋白.此方法为蛋白纯化最常用的方法。

而野生菌纯化则是通过离子交换层析、疏水层析、尺寸排阻层析(凝胶过滤)等方法原理,从野生菌中直接获得某种蛋白的蛋白纯化方法。

其中重组载体的构建主要由分为三个步骤:1)目的基因片段的获得;2)酶切及切胶回收;3)酶连、转化及保存等

1.1目的基因片段的获得(对应编号1-1)

选用合适的质粒作为载体,并选择合适的双酶切位点。

以相应菌株的基因组为模板,设计相应引物,利用PCR仪对目的基因进行扩增,获得大量的目的基因片段。

1.2酶切及切胶回收(对应编号1-2)

将PCR获得的目的基因片段和提取的质粒同时进行双酶切处理,该过程需要在恒温水浴槽中37℃中酶切40 min。

对酶切之后的反应液利用水平电泳仪进行TAE琼脂糖凝胶电泳,在凝胶成像系统下切下目的片段及酶切后的载体片段,用DNA纯化回收试剂盒进行纯化回收,该回收过程需要多次用到小型高速离心机。

1.3酶连、转化及保存(对应编号1-3、1-4)

用T4 DNA Ligase对切胶回收后的目的片段和载体质粒进行酶连实验,该过程需要在恒温水浴槽中25℃中酶连30 min左右,最终将酶连产物通过转化转入克隆宿主。

转化的方法有两种,第一种方法是通过电转化法,直接通过电转仪将重组后的质粒转入克隆宿主,省时高效;另一种方法是将连接液加入到感受态细胞中,冰浴30 min,之后37℃水浴5 min,冰上放置3 min,之后超净台中加入500 μL LB培养基,37℃振荡培养箱振荡培养约1 h。

将上述培养液在超净工作台进行平板涂布,过夜培养观察平板菌落生长情况。

通过PCR验证与测序挑选正确的转化子,并将正确的转化子转入到表达宿主中,经PCR验证后将含有重组质粒的表达宿主甘油处理,并保存在超低温冰箱的-80℃环境中。

2、蛋白的上柱纯化

蛋白的上柱纯化主要分为四个步骤组成:1)目的细胞的培养;2)目的细胞的破碎及离心;3)目的蛋白上柱纯化及浓缩脱盐等。

2.1 目的细胞的培养(对应编号2-1)

对于异源表达纯化来说,需对上述含有重组质粒的表达宿主进行诱导表达。

一般方法如下(假设表达宿主为BL21(DE3),载体为pET28b(+)):将测序成功的含有重组质粒的表达宿主在超净工作台接种至LB培养基,在大容量恒温振荡器中37℃、170 rpm培养至OD值达到0.8-1.0时,加入诱导剂IPTG(终浓度一般为0.5 mM),降低温度和转速至30℃、130 rpm,过夜诱导后利用大容量高速冷冻离心机收菌,并用pH 7.0的50 mM磷酸钠清洗两遍,-20℃保存细胞。

而对于野生菌纯化来说,只需在该菌株最适生长条件之下培养获得大量菌体,以备下一步试验所需。

该过程中培养基以及以下步骤所需的缓冲液均需要pH计来调剂pH。如果所需目的细胞为厌氧细胞,需用厌氧手套箱进行培养基的配制。

2.2 目的细胞的破碎及离心(对应编号2-2、2-3)

将目的细胞用缓冲液重悬,并用高压细胞破碎仪破碎目的细胞,如果是革兰氏染色阳性的细胞,需在菌悬液中添加溶菌酶,并在37℃下恒温水浴30 min。

细胞破碎液用高速冷冻离心机在35000 ×g、4℃下离心30 min,将上清用0.22 μm滤头过滤,最终获得上清粗酶液。

对于膜蛋白组分,需用超速离心机进行离心。

2.3 目的蛋白上柱纯化(对应编号2-4、2-5)

对于异源表达纯化来说,将上述步骤制备的粗酶液通过蠕动泵上样到以亲和层析为主的蛋白纯化柱上(此处以常用的His-Tag和Ni柱为例)。

将上样完成的Ni柱利用蛋白纯化仪进行咪唑梯度蛋白洗脱,并将每个梯度的样品分别收取,并利用浓缩管和高速冷冻离心机对蛋白进行浓缩脱盐,用于目的蛋白的验证和表征。

相比异源表达纯化,野生菌纯化要复杂得多。首先需知道所要纯化蛋白的基本性质,比如所催化的基础反应。

利用此反应,依据不同的纯化原理来进一步捕获和纯化蛋白,该过程需要蛋白纯化仪的支持。

如首先通过蠕动泵上样离子交换层析柱(通常用Q柱或DEAE柱),该层析柱通过逐步提高盐浓度洗脱蛋白,依据目的蛋白所催化的基础反应捕获蛋白,该过程通常需要用到电脑实时监测的双光束紫外可见分光光度计。

当监测到目的蛋白所在梯度后,对该梯度进行蛋白浓缩,并将缓冲液换成疏水层析柱(一般为苯基柱)的缓冲液。

将上述样品通过蠕动泵上样苯基柱,该层析柱需要逐步降低盐浓度来洗脱蛋白,依据目的蛋白所催化的基础反应进一步蛋白,并将目的蛋白梯度浓缩脱盐。

再将上一步样品利用尺寸排阻层析柱(分子筛)进一步纯化蛋白样品,最终获得较纯的蛋白样品,用于蛋白生理生化性质的分析,还可通过分子筛测定蛋白的分子量,并预测蛋白亚基的聚合形式。

3、蛋白性质分析

对于蛋白的生理生化性质的测定,主要包括以下几个方面:1)蛋白浓度测定及SDS-PAGE电泳;2)催化性质及其产物测定;3)辅基测定;4)蛋白结构解析等。

3.1 蛋白浓度测定及SDS-PAGE电泳(对应编号3-1)

对于蛋白浓度的测定,一般以牛血清白蛋白为标准品,用Bradford法进行测定,该测定须使用紫外可见分光光度计。

SDS-PAGE电泳首先对蛋白样品进行处理,选择合适浓度的蛋白样品,加入蛋白loading,100℃金属浴10 min,经小型高速离心机离心后,在垂直电泳槽中点样,最终完成蛋白电泳。

3.2 催化性质及其产物测定(对应编号3-2、3-4)

对于目的蛋白催化性质的测定,一般可使用电脑实时监测的双光束紫外可见分光光度计来完成,通过监测底物的消耗或产物的生成监测反应进行,并可通过计算酶活曲线的斜率计算比酶活。

有的反应因底物产物较为相似,无法用紫外可见分光光度计分开,这时需要高效液相色谱(HPLC)来监测反应的进行,一般通过监测单位时间内产物的生成来计算比酶活。

3.3 辅基测定(对应编号3-3)

对于蛋白辅基的测定,测定方法多种多样。

如Fe含量的测定,通常使用 Ferene法,该方法需用到紫外可见分光光度计和金属浴。

对于蛋白中其他离子的鉴定与定量如Zn、Mo、W和S等,其最便捷高效的方法就是使用原子吸收光谱进行测定。

而对于其他辅基如FAD、FMN等,其最简便的鉴别定量方法是利用HPLC进行监测。

3.3 蛋白结构解析(对应编号3-5、3-6)

目前对于蛋白质二级结构的研究,其主要手段之一是利用圆二色光谱进行鉴定,该方法广泛应用于蛋白质的构象研究中。

而对于蛋白质三级结构的解析,主要的方法包括X-射线衍射法、核磁共振和冷冻电镜。

其中X-射线衍射法需要先对蛋白进行结晶,然后利用X-射线衍射仪进行结构分析,因此适用于较小分子蛋白质的结构解析,因为大分子蛋白很难结晶,该方法同样很难捕捉蛋白质动态变化过程;

核磁共振依据强磁场中原子和对射频辐射的吸收作用,需要用到核磁共振波谱仪进行研究,该方法可以捕捉蛋白质分子动力学,但是仅适用于小分子蛋白;

冷冻电镜是近年来兴起的蛋白质结构测定方法,难以结晶的膜蛋白以及生物大分子复合体可用此方法进行解析。#木木西里# #实验方案# #微生物蛋白#

【第三届南海文艺奖获奖作品】评论《海南疍家音乐形态整理与传承传播问题研究与展望》

作品欣赏详见以下网址:
https://t.cn/A65376MF

作品简介:

本文刊发在中国传媒大学主办全国唯一一本音乐传播杂志《音乐传播》上,是研究海南疍家音乐历史与文化的理论文章。

海南疍家音乐“水上民歌”——是疍家人重要的精神生活方式,更是一个鲜活有形的文化载体,通过这个活的音乐形态,我们可以回顾和梳理疍民的历史流变和时代变迁,并通过这个有声的载体,去探索、去发现疍民千百年的迁徒史,去深刻透视和反思这个发生在中国的一部漫长而又波澜壮阔的移民史。通过这个活态的艺术,让我们能够亲切地感悟到海洋文化的厚重与滋味,并充满好奇和不断地向深处去探索,去挖掘其中所蕴含的历史价值、文化价值与艺术传播价值……

作品曾获奖情况:

1、基于海南优秀传统文化传承传播——疍家“水上民歌”大学生演艺团(获批国家级高校创新创业项目)在研。

2、合唱《南海天书》参加三亚万人合唱比赛获得一等奖第一名。

作品社会反响:

1、四场音乐广播剧《向海而歌——海南疍家女儿的婚礼》创新项目紧张排练中。
2、编创疍家“水上民歌”《十月种花》参加全国疍民音乐文化与城市旅游演艺学术会议演出。
3、海南疍家音乐常态化传承传播探索与思考《当代音乐》发表。
4、完成《以舟为家·向海而歌--疍家“水上民歌”历史文化与传播研究》(研究报告21万字,其中部分章节已经与《音乐生活》杂志签约,特别安排海南疍家音乐历史文化专栏,2020年——2021年全年每月一期连载。
5、《三亚疍歌》国家非物质文化遗产项目申报——被聘请为专家。

作者简介:

赵世兰,三亚学院作为高级人才引进,音乐学院教授,学校教学督导专家,研究生导师。

一、学术兼职
1、中国民族声乐研究会理事
2、中国音乐家协会会员

二、获奖简介
1、2009年第二届全国高等艺术院校民族声乐大赛获优秀指导教师奖
2、2010年第二届全国音乐文化艺术展演活动”获优秀指导教师奖
3、2012年“全国高校联盟声乐比赛获优秀指导教师奖
4、2013年全国“珠江·凯撒宝”声乐大赛获得优秀指导教师奖
(注:获得一等奖的学生颁发优秀教师奖证书)
5、2014年获第三届全国高校民族声乐大赛优秀指导教师奖
6、2016年获第四届全国高校民族声乐大优秀指导教师奖
7、《高校声乐考级实施方案》获得全国音乐教育优秀论文二等奖
8、首届“鄂尔多斯之恋”全国声乐大赛优秀指导教师奖
9、2012年主持《高校音乐教育与城市文化建设互动研究》获得成果奖励

三、科研成果

长期致力于声乐表演、教学、音乐教育等方面的理论与实践研究,主要著述和教材5部:专著《20世纪中国民族声乐文化引论》、《中国艺术歌曲选集》(人民音乐出版社)、《歌唱与分析》、《新编中国民族声乐曲选》、《新编中国歌剧曲选》,参与国家教师资格证考试教材编写;在《中国音乐》、《人民音乐》、《音乐创作》、《乐府新声》、《音乐传播》、《音乐与表演》、《音乐生活》、《歌唱艺术》、《艺术研究》、《中国文化产业》、《辽宁师范大学学报》等专业刊物发表论文40余篇,并有多篇论文被CSSCI收录。

四、教学成果奖

作为第二主持人主持的教学研究项目《音乐表演专业培养目标的理论与实践》,获得辽宁省高校优秀教学成果奖。

五、科研项目

主持和参与省部级项目多项:《20世纪中国民族声乐文化研究》、《中国百年声乐文献与音像研究》、《音乐文化与审美研究》、《高校音乐教育实践与城市文化建设互动模式研究》等。

郭建民:三亚学院作为高级人才引进,教授、研究生导师、音乐学院学术委员会主任。

一、学术兼职及评估评审专家

1、教育部高等院校本科教育教学合格评估专家
2、中国声乐家协会执行主席
3、中国音乐教育声乐学术委员会副主任
4、中国民族声乐艺术研究会常务理事
5、教育部第十次学位评审专家
6、教育部人文社科研究项目(2008、2010、2012、2013、2015、2016、2018、2019年度)评审专家
7、教育部“艺术学”一级学科评估评审专家
8、省政府哲学社会科学成果评审专家组成员
9、北京大学高校音乐剧联盟秘书长

二、重要赛事评委及学术活动

1、2011“香港国际声乐比赛”美声组评委
2、2012第三届全国高校“孔雀奖”声乐比赛民族组评委
3、2015第三届全国高校民族声乐比赛评委
4、2013年珠江杯“凯撒堡”全国声乐优秀论文比赛评委
5、2017年东北师大博士论文开题及论文答辩专家
6、2018全国首届“鄂尔多斯之恋”声乐大赛评委
7、2019中国音乐学院《中国声乐艺术研究》国家重大课题开题评审专家
8、2017年度国家社科项目结项评审专家
9、2019年度国家社科项目结项评审专家

三、代表性科研成果

本人长期致力于音乐表演、教学、音乐教育、音乐文化、音乐评论、音乐传播等领域的理论与实践研究。

(一)、主要著述及获奖

1、专著教材类:《歌唱与分析》、《20世纪中国民族声乐文化引论》、《声乐文化学》(上海音乐出版社)、《声乐教育学》(上海音乐出版社)、声乐曲库:《中国艺术歌曲集2004——2010》上、下册(人民音乐出版社)、《新编中国歌剧曲选》(上海音乐出版社)、与其他专家主编《音乐教师资格证考试》(指定用书、北京大学出版社)等。

(二)、主要论文

在《音乐研究》、《中国音乐学》、《中国音乐》、《人民音乐》、《黄钟》、《中国音乐教育》、《中国文化产业》、《中国教育报》、《中国文化报》、《中国经济日报》、《中国艺术报》、《乐府新声》、《音乐与表演》、《音乐生活》、《歌唱艺术》、《音乐传播》、《当代音乐》等杂志上发表学术论文90余篇,达60余万字,其中《中国歌剧八大优势》中国文化报发表,被《新华文摘》转引,并有多篇论文CSSCI收录。

(三)、主要奖项

1、《20世纪20--60年代中国歌剧表演艺术》2002年获得辽宁省政府第八届哲学、社会科学优秀科研成果论文类二等奖

2、《声乐文化学》2012年获得辽宁省政府第十二届哲学、社会科学优秀科研成果专著类二等奖

3、《音乐表演专业培养目标的研究与实践》2009年(辽宁省第六届高校优秀教学成果三等奖)

4、全国高校联盟声乐比赛优秀指导教师奖(中国音乐家协会)

5、全国高校民族声乐大赛优秀指导教师奖(中国民族声乐艺术研究会)

6、《高校音乐教育引领城市大众精神文化》第二届全国音乐传播优秀论文三等奖(中国音乐传播学会)

7、《高校音乐教育的四种现象》2017年第四届中国音乐教育优秀论文三等奖(中国音乐家协会)

8、第一届“长白山”杯声乐大赛优秀指导教师一等奖2017年(吉林省音乐家协会)

9、全国首届“鄂尔多斯之恋”声乐大赛2018年优秀指导教师奖

10、第二届“长白山”杯声乐大赛优秀指导教师一等奖2018年(吉林省音乐家协会)

(四)、科研项目

1、与王耀华共同完成教育部重点项目《高校音乐教育专业师资培养模式与研究生教育改革》

2、《20世纪中国民族声乐文化研究》高校人文研究项目

3、《世纪百年声乐文献与音像研究》高校人文研究项目

4、《声乐文化与审美研究》高校人文研究项目

5、《音乐教育与城市文化产业结构整合研究》政府软科学研究项目

6、《高校音乐教育实践教学与城市文化建设互动模式研究》高校教教育教学研究项目

7、《海南高校应用型音乐人才分类培养模式研究》海南高校教育教学改革项目

8、基于海南地方传统文化传承传播——疍家“水上民歌”大学生演艺团(国家级大创项目,2019年12月获得海南省大学生艺术展演优秀创作奖)

9、弘扬主旋律——中国歌剧大学生表演团(海南省大创醒目)

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无论有多困难,都坚强地抬头挺胸,人生是一场醒悟,不要昨天,不要明天,只要今天。活在当下,放眼未来。人生是一种态度,静自然天地宽。不一样的你我,不一样的态,不一样的人生。事不必遗憾。若是美好,叫做精彩。若是糟糕,叫做经历。把握无论有多困难,都坚强地抬头挺胸,人生是一场醒悟,不要昨天,不要明天,只要今天。活在当下,放眼未来。人生是一种态度,静自然天地宽。不一样的你我,不一样的态,不一样的人生。事不必遗憾。若是美好,叫做精彩。若是糟糕,叫做经历。把握眼前,当下才重要。


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