#2021考研党# 初试应对
1. 做好考前准备
(1) 看考场。时间一般是考试前一天下午16:00以后，最好看考场的时候提前找好来回考场最快的路径和吃饭的地方。
(2) 出门前检查证件是否带全，证件包括:准考证、有效身份证件(身份证、 军人身份证件)等。
( 3 ) 弄清时间。考试时间两天的上午下午分别看清楚，不要想当然，进考场的时间是不一样的。
( 4 ) 控制好节奏。一般来说，政治和专业课考试时间较为充裕，但英语和数学考试时间比较紧张，要注意控制好时间节奏。
( 5 ) 控制心理和情绪。尽量放松，不要紧张。但如果出现适度的紧张却是一件好事，可以最大程度地发挥你的潜能。因此根本没必要为此担心。
2.弄清考试规则
（1）考生应在考试前一天到考试地点了解考场及有关注意事项。
（2）考生不得携带任何书刊、报纸、稿纸、资料、通讯工具或有存储、编程、查询功能的电子用品进入考场。只准带必需的文具，如蓝(黑)色字迹钢笔、圆珠笔、签字笔、铅笔和橡皮、绘图仪器以及无字典存储和编程功能电子计算器，或根据招生单位在准考证上注明的所需携带的用具。
（3）考生应在每科开考前10分钟，凭准考证、有效身份证件(身份证、军人身份证件)进入考场，对号入座。入座后将准考证、身份证等放在桌面左上角，以备查对。
（4）不到规定的开考时间，考生不得拆启试题。
（5）考生除在试卷上填写(涂)规定的项目外，不得作其他任何标记，否则答卷作废。
（6）考生答题必须用蓝(黑)色字迹钢笔、圆珠笔或签字笔书写，涂写答题卡须使用2B铅笔。字迹要工整、清楚，填涂要规范，不得使用涂改液。答案书写在草稿纸上的一律无效。
（7）考生对试题内容有疑问时，不得向监考人员询问。但遇试题分发错误和字迹模糊问题，可举手询问。
（8）考生迟到15分钟不得入场。交卷出场时间不得早于每科目考试结束前30分钟，交卷出场后不得再进场续考，也不得在考场附近逗留或交谈。
（9）考生在考场内必须保持安静，不准吸烟。交卷后，不得在考场附近逗留、谈论。
（10）考生不准交头接耳，不准偷看、夹带、抄袭或者有意让他人抄袭答题内容，不准接传答案或者交换答卷等。
（11）考试终了时间一到，考生应立即停止答卷，并将试题、答题卡、答题纸(或答卷)装入原试题袋内并密封。经监考人员逐个核查无误后，方可逐一离开考场，试题、答题卡、答题纸(或答卷)和草稿纸不准带走。
3. 正确面对公共课考试
由于研究生入学考试是选拔性考试，所以必然公共课至少有一门难度比较大以区分考生，有时候公共课的分数都比较低;如果大家考试时遇到一门比较难，要有足够的心理承受能力。如果题目难了大家都分低，而且分数线也会相应降低。
（1）政治考试
考前的晚上可以按照政治冲刺班理顺的思路去快速回顾整个科目。在心里模拟一下可能出现什么样的题。
拿到试卷后，先粗略浏览一遍，做到心里有数。将会做的题先答好;当然，也最好是按照试卷顺序，这里做一块那里做一块容易让自己混乱，而且容易遗漏。对于拿不准的题目先越过去，尤其是不定向选择题这块容易翻船的阵地。千万不要在这上面耗时间，相信自己的分析和第一感觉,把能做的都做了。等把主观题等全部做完填满，有剩余时间的时候再回头来斟酌不定向选择题。
分析题要结合材料答题，千万不要脱离材料，但也不要照抄材料。主观题答题原则是“多答要点，少展开”，看到要点老师就会给分。另外牢记:卷面要整洁。判卷老师在密集的劳动下容易疲倦，卷面整洁一定会为 自己赢得他们的第一好感。
政治时间分配:选择题一般为30分钟以内，最多用40分钟，其余的全部用来写主观题，平均20分每题，最多不超过30分钟。
（2）英语考试
一般来说经过上午紧张考试后，下午都有些疲劳，所以中午最好先休息下。发考题时，最好快速填好姓名。阅读是主要得分点，一般都强调在这上面投入。但也要根据情况，自己在哪方面是强项，就要在哪方面全神贯注。另外，考前一定要背几篇范文的开头结尾和常用句型。
英语考试分值分配:完型填空10分，阅读理解40分，新题型10分，英译汉10 分，小作文10分，大作文20分。时间分配大致是完型填空10分钟，阅读理解加新题型控制在80分钟以内，英译汉20 —30分钟，大小作文60分钟。每年最难的是英译汉，平均分大概只有3-4分。大家可以根据自己的情况合理分配时间。
（3）数学考试
平常做题和真正上考场是两回事，心态的变化会使人在考场上思维有些过于活跃而无法集中，会影响发挥，但是不要紧，一定要想:大家都一样。有时候题目不是很难，却很不顺手，平常5分钟就能做出的题，考试的时候会犹疑——总觉得不可能那么简单，反复琢磨，白白耽搁时间。要胆大心细，最重要是相信自己平时的训练。最后即使耽搁了也不用花时间惋惜，一道题是一道题，好好做下去。
数学时间分配:数学选择题加填空题的时间最多不超过45分钟，其他全部用于解答题部分。
4. 轻松进行专业课考试
一句话，自己对自己的体力和精神承受力要有充分认识。没精力的话，好好休息，把头脑休息清醒的对付考试;有时间有精力的话，进考场前可以再翻翻专业课书，要看重点，有些题就是这样撞到的。
5. 考试过程中的答题提醒
(1) 政治: 客观题在答题卡上回答，主观题在答题纸上回答。
在回答主观题目的时候，建议控制字数，并且分条回答，尽量做到有条理。即使你很紧张，脑子里没有思路，也不要在你的字迹上显示出来。对于有多个小问的问题，如果觉得前面的某一小问还没有答完整又一时想不起来的话，那么应该给它留出一些空间再答下一小问。选做题一定要选清楚了，不要因为太兴奋，一下子把两道选做题都答了，这样会浪费时间哦!
(2)英语: 英语答题卡不同于大学英语等级考试的答题卡。
考研英语答题卡分为两张，一张是客观题目的，一张是主观题目的。客观答题卡与四六级考试的差距不大，只是新题型等部分的选项要多于四个，会出现e，f等 选项，这地方的涂卡要特别注意。
主观题答题卡上要写的是翻译和大小作文，正面上部分是翻译答题部分，翻译的左侧是考生信息。翻译的下面是小作文，答题卡背面是大作文。这需要你合理安排空间，字迹清楚，卷面整洁干净。这些对于你的主观题目得分有很大影响。你一定要控制字体的大小，并且一定要做到心中有数，再落笔，否则一旦写错了，改起来不难(斜画两道就可以了，切忌把写错的部分涂成一个大乌龟的做法!)，如果是一句话写错了，就很难改了，所以下笔之前要考虑清楚，没有太多的地方让你涂改。而且答题的空间比较小，建议字缩小一些,就算作文再好写，也要选你想到的精华内容写，当然控制篇幅也很重要。
还有一点和考四六级不一样的是:考研英语不用考到半截的时候收你的试卷。
（3）数学考试所有题都在答题卡上。
考研数学考试试题卷和答题卷是分开的两本，所有答案需要写在答题卷上，尽量安排好答题空间，如果不会做，可以先放放，等所有题目答完，再回来做不会的。一定要学会放弃不会做的，或者是暂时放弃不会做的，不要为了一道题目苦苦思考很长时间，最后会做的题目无法解答，不要吊死在一棵树上。
（4）专业课
专业课部分，对于使用计算器的科目，一定要准备好计算器， 别到时候忘记了，还要记得带电池。
专业课的试题一般也是回答在答题纸上，都是没有格子的白纸，所以你一定要书写整齐，也没有必要去画格子。如果有选择题，没有格子你也不用画，一行就只写一个题的答案，标清楚题号，就可以了。
6. 做好自我调节
（1）关于睡眠
考前最重要的是休息好，只有这样考试时才能保持头脑清醒，也要少上网。如果出现了失眠，可以用自己常用的方法好好调整，不要心急，慢慢来，起来翻翻书，但要翻那种容易让自己困倦的书。
即使这两个晚上都没有睡好，也不要念念不忘，因为人的潜力是无穷的，两个晚上没睡好在这个时候没太大关系，因为考场上神经的亢奋足以抵消疲倦感，所以不用过分担心，反而是惴惴不安于已经过去的睡眠时间会影响你的考场发挥。
当一门考试结束时，考生要积极地调整心态，不要计较得失,将精力全部放在下一门考试上，争取更好成绩。
（2）关于饮食
第一，考前可以补充一些提神的东西，如红牛，巧克力等。但平时不常喝咖啡的人，就不要在这个时候尝试了，因为有些人可能会过于亢奋而无法精力集中。
第二，考试时可以带水杯进考场，准备一些热水。口渴时润润嘴唇嗓子就行，不要多喝，否则上厕所会浪费不少时间。
第三，吃正餐时，不要吃过于辛辣、油腻的东西，不要吃凉菜。总之，不冒险吃任何有可能导致不良反应的菜。每餐都尽量包括一个绿色蔬菜，但它定要是干净、十分熟的。午餐一定要包含淀粉类食物，即米饭、馒头等，否则下午一定会饿;但不要过饱，否则会阻塞思路想睡觉，八分饱就行，加碗清淡热汤。
第四，别太紧张。吃进去的东西都会发挥它们的作用，为你贡献热量赢得分数的。要放松，要相信在这个重要时刻，你的全身各个部位都在良好合作，为未来发挥自己最大力量，没有什么比这更好了。
（五）初试地点
应届本科毕业生原则上选择就读学校所在省(区、市)的考点考试;非应届本科毕业生单独考试考生在招生单位所在地省级教育招生考试管理机构指定的报考点进行考试;工商管理、公共管理、旅游管理和工程管理等专业学位考生和其他考生在工作或户口所在地省级教育招生考试管理机构指定的考场应试。
考生在每科考试开考15分钟后不得入场。初试交卷出场时间不得早于每科目考试结束前30分钟，具体出场时间由省级教育招生考试管理机构规定，交卷出场后不得再进场续考，也不得在考场附近逗留或交谈。
（六）考后须知
1. 考试成绩和试卷的查阅
招生单位对考生成绩的评定、统分、登记是严肃认真的，一般是准确无误的。现在开始实行网上评卷。如考生对某个科目的考试成绩有怀疑，可向招生单位提出申请，经招生单位办公室审查同意，由专人负责复查，并将结果通知考生本人。考生本人不得直接查阅试卷的成绩，更不得查阅试卷。
2. 有关硕士研究生初试补考的具体规定
因非考生本人原因(如试题错寄、漏寄、邮递故障等情况)而影响考生正常考试的，各考点应将初步审查同意的考生姓名、报考单位、补考科目及补考原因一一写明，报所在省(市、自治区)高校招生办审核，经批准后方可安排补考。同时函告考生报考单位，请他们寄来补考试题。
各补考科目均由招生单位命题。补考试题的难易程度应与统考相致。
补考时间一般安排在统考结束的一个月以后进行，具体时间由教育部另行通知。
（七）初试成绩的公布
研究生入学考试初试成绩是否公布，何时公布，由招生单位自行确定。公布入学考试成绩的招生单位，一般是在确定初选名单时才将考试成绩通知考生本人。
1. 做好考前准备
(1) 看考场。时间一般是考试前一天下午16:00以后，最好看考场的时候提前找好来回考场最快的路径和吃饭的地方。
(2) 出门前检查证件是否带全，证件包括:准考证、有效身份证件(身份证、 军人身份证件)等。
( 3 ) 弄清时间。考试时间两天的上午下午分别看清楚，不要想当然，进考场的时间是不一样的。
( 4 ) 控制好节奏。一般来说，政治和专业课考试时间较为充裕，但英语和数学考试时间比较紧张，要注意控制好时间节奏。
( 5 ) 控制心理和情绪。尽量放松，不要紧张。但如果出现适度的紧张却是一件好事，可以最大程度地发挥你的潜能。因此根本没必要为此担心。
2.弄清考试规则
（1）考生应在考试前一天到考试地点了解考场及有关注意事项。
（2）考生不得携带任何书刊、报纸、稿纸、资料、通讯工具或有存储、编程、查询功能的电子用品进入考场。只准带必需的文具，如蓝(黑)色字迹钢笔、圆珠笔、签字笔、铅笔和橡皮、绘图仪器以及无字典存储和编程功能电子计算器，或根据招生单位在准考证上注明的所需携带的用具。
（3）考生应在每科开考前10分钟，凭准考证、有效身份证件(身份证、军人身份证件)进入考场，对号入座。入座后将准考证、身份证等放在桌面左上角，以备查对。
（4）不到规定的开考时间，考生不得拆启试题。
（5）考生除在试卷上填写(涂)规定的项目外，不得作其他任何标记，否则答卷作废。
（6）考生答题必须用蓝(黑)色字迹钢笔、圆珠笔或签字笔书写，涂写答题卡须使用2B铅笔。字迹要工整、清楚，填涂要规范，不得使用涂改液。答案书写在草稿纸上的一律无效。
（7）考生对试题内容有疑问时，不得向监考人员询问。但遇试题分发错误和字迹模糊问题，可举手询问。
（8）考生迟到15分钟不得入场。交卷出场时间不得早于每科目考试结束前30分钟，交卷出场后不得再进场续考，也不得在考场附近逗留或交谈。
（9）考生在考场内必须保持安静，不准吸烟。交卷后，不得在考场附近逗留、谈论。
（10）考生不准交头接耳，不准偷看、夹带、抄袭或者有意让他人抄袭答题内容，不准接传答案或者交换答卷等。
（11）考试终了时间一到，考生应立即停止答卷，并将试题、答题卡、答题纸(或答卷)装入原试题袋内并密封。经监考人员逐个核查无误后，方可逐一离开考场，试题、答题卡、答题纸(或答卷)和草稿纸不准带走。
3. 正确面对公共课考试
由于研究生入学考试是选拔性考试，所以必然公共课至少有一门难度比较大以区分考生，有时候公共课的分数都比较低;如果大家考试时遇到一门比较难，要有足够的心理承受能力。如果题目难了大家都分低，而且分数线也会相应降低。
（1）政治考试
考前的晚上可以按照政治冲刺班理顺的思路去快速回顾整个科目。在心里模拟一下可能出现什么样的题。
拿到试卷后，先粗略浏览一遍，做到心里有数。将会做的题先答好;当然，也最好是按照试卷顺序，这里做一块那里做一块容易让自己混乱，而且容易遗漏。对于拿不准的题目先越过去，尤其是不定向选择题这块容易翻船的阵地。千万不要在这上面耗时间，相信自己的分析和第一感觉,把能做的都做了。等把主观题等全部做完填满，有剩余时间的时候再回头来斟酌不定向选择题。
分析题要结合材料答题，千万不要脱离材料，但也不要照抄材料。主观题答题原则是“多答要点，少展开”，看到要点老师就会给分。另外牢记:卷面要整洁。判卷老师在密集的劳动下容易疲倦，卷面整洁一定会为 自己赢得他们的第一好感。
政治时间分配:选择题一般为30分钟以内，最多用40分钟，其余的全部用来写主观题，平均20分每题，最多不超过30分钟。
（2）英语考试
一般来说经过上午紧张考试后，下午都有些疲劳，所以中午最好先休息下。发考题时，最好快速填好姓名。阅读是主要得分点，一般都强调在这上面投入。但也要根据情况，自己在哪方面是强项，就要在哪方面全神贯注。另外，考前一定要背几篇范文的开头结尾和常用句型。
英语考试分值分配:完型填空10分，阅读理解40分，新题型10分，英译汉10 分，小作文10分，大作文20分。时间分配大致是完型填空10分钟，阅读理解加新题型控制在80分钟以内，英译汉20 —30分钟，大小作文60分钟。每年最难的是英译汉，平均分大概只有3-4分。大家可以根据自己的情况合理分配时间。
（3）数学考试
平常做题和真正上考场是两回事，心态的变化会使人在考场上思维有些过于活跃而无法集中，会影响发挥，但是不要紧，一定要想:大家都一样。有时候题目不是很难，却很不顺手，平常5分钟就能做出的题，考试的时候会犹疑——总觉得不可能那么简单，反复琢磨，白白耽搁时间。要胆大心细，最重要是相信自己平时的训练。最后即使耽搁了也不用花时间惋惜，一道题是一道题，好好做下去。
数学时间分配:数学选择题加填空题的时间最多不超过45分钟，其他全部用于解答题部分。
4. 轻松进行专业课考试
一句话，自己对自己的体力和精神承受力要有充分认识。没精力的话，好好休息，把头脑休息清醒的对付考试;有时间有精力的话，进考场前可以再翻翻专业课书，要看重点，有些题就是这样撞到的。
5. 考试过程中的答题提醒
(1) 政治: 客观题在答题卡上回答，主观题在答题纸上回答。
在回答主观题目的时候，建议控制字数，并且分条回答，尽量做到有条理。即使你很紧张，脑子里没有思路，也不要在你的字迹上显示出来。对于有多个小问的问题，如果觉得前面的某一小问还没有答完整又一时想不起来的话，那么应该给它留出一些空间再答下一小问。选做题一定要选清楚了，不要因为太兴奋，一下子把两道选做题都答了，这样会浪费时间哦!
(2)英语: 英语答题卡不同于大学英语等级考试的答题卡。
考研英语答题卡分为两张，一张是客观题目的，一张是主观题目的。客观答题卡与四六级考试的差距不大，只是新题型等部分的选项要多于四个，会出现e，f等 选项，这地方的涂卡要特别注意。
主观题答题卡上要写的是翻译和大小作文，正面上部分是翻译答题部分，翻译的左侧是考生信息。翻译的下面是小作文，答题卡背面是大作文。这需要你合理安排空间，字迹清楚，卷面整洁干净。这些对于你的主观题目得分有很大影响。你一定要控制字体的大小，并且一定要做到心中有数，再落笔，否则一旦写错了，改起来不难(斜画两道就可以了，切忌把写错的部分涂成一个大乌龟的做法!)，如果是一句话写错了，就很难改了，所以下笔之前要考虑清楚，没有太多的地方让你涂改。而且答题的空间比较小，建议字缩小一些,就算作文再好写，也要选你想到的精华内容写，当然控制篇幅也很重要。
还有一点和考四六级不一样的是:考研英语不用考到半截的时候收你的试卷。
（3）数学考试所有题都在答题卡上。
考研数学考试试题卷和答题卷是分开的两本，所有答案需要写在答题卷上，尽量安排好答题空间，如果不会做，可以先放放，等所有题目答完，再回来做不会的。一定要学会放弃不会做的，或者是暂时放弃不会做的，不要为了一道题目苦苦思考很长时间，最后会做的题目无法解答，不要吊死在一棵树上。
（4）专业课
专业课部分，对于使用计算器的科目，一定要准备好计算器， 别到时候忘记了，还要记得带电池。
专业课的试题一般也是回答在答题纸上，都是没有格子的白纸，所以你一定要书写整齐，也没有必要去画格子。如果有选择题，没有格子你也不用画，一行就只写一个题的答案，标清楚题号，就可以了。
6. 做好自我调节
（1）关于睡眠
考前最重要的是休息好，只有这样考试时才能保持头脑清醒，也要少上网。如果出现了失眠，可以用自己常用的方法好好调整，不要心急，慢慢来，起来翻翻书，但要翻那种容易让自己困倦的书。
即使这两个晚上都没有睡好，也不要念念不忘，因为人的潜力是无穷的，两个晚上没睡好在这个时候没太大关系，因为考场上神经的亢奋足以抵消疲倦感，所以不用过分担心，反而是惴惴不安于已经过去的睡眠时间会影响你的考场发挥。
当一门考试结束时，考生要积极地调整心态，不要计较得失,将精力全部放在下一门考试上，争取更好成绩。
（2）关于饮食
第一，考前可以补充一些提神的东西，如红牛，巧克力等。但平时不常喝咖啡的人，就不要在这个时候尝试了，因为有些人可能会过于亢奋而无法精力集中。
第二，考试时可以带水杯进考场，准备一些热水。口渴时润润嘴唇嗓子就行，不要多喝，否则上厕所会浪费不少时间。
第三，吃正餐时，不要吃过于辛辣、油腻的东西，不要吃凉菜。总之，不冒险吃任何有可能导致不良反应的菜。每餐都尽量包括一个绿色蔬菜，但它定要是干净、十分熟的。午餐一定要包含淀粉类食物，即米饭、馒头等，否则下午一定会饿;但不要过饱，否则会阻塞思路想睡觉，八分饱就行，加碗清淡热汤。
第四，别太紧张。吃进去的东西都会发挥它们的作用，为你贡献热量赢得分数的。要放松，要相信在这个重要时刻，你的全身各个部位都在良好合作，为未来发挥自己最大力量，没有什么比这更好了。
（五）初试地点
应届本科毕业生原则上选择就读学校所在省(区、市)的考点考试;非应届本科毕业生单独考试考生在招生单位所在地省级教育招生考试管理机构指定的报考点进行考试;工商管理、公共管理、旅游管理和工程管理等专业学位考生和其他考生在工作或户口所在地省级教育招生考试管理机构指定的考场应试。
考生在每科考试开考15分钟后不得入场。初试交卷出场时间不得早于每科目考试结束前30分钟，具体出场时间由省级教育招生考试管理机构规定，交卷出场后不得再进场续考，也不得在考场附近逗留或交谈。
（六）考后须知
1. 考试成绩和试卷的查阅
招生单位对考生成绩的评定、统分、登记是严肃认真的，一般是准确无误的。现在开始实行网上评卷。如考生对某个科目的考试成绩有怀疑，可向招生单位提出申请，经招生单位办公室审查同意，由专人负责复查，并将结果通知考生本人。考生本人不得直接查阅试卷的成绩，更不得查阅试卷。
2. 有关硕士研究生初试补考的具体规定
因非考生本人原因(如试题错寄、漏寄、邮递故障等情况)而影响考生正常考试的，各考点应将初步审查同意的考生姓名、报考单位、补考科目及补考原因一一写明，报所在省(市、自治区)高校招生办审核，经批准后方可安排补考。同时函告考生报考单位，请他们寄来补考试题。
各补考科目均由招生单位命题。补考试题的难易程度应与统考相致。
补考时间一般安排在统考结束的一个月以后进行，具体时间由教育部另行通知。
（七）初试成绩的公布
研究生入学考试初试成绩是否公布，何时公布，由招生单位自行确定。公布入学考试成绩的招生单位，一般是在确定初选名单时才将考试成绩通知考生本人。
注意啦！2019严查高新技术企业！税务稽查，工资薪金是重点
说起高新技术企业，可谓“税之骄子”！企业所得税减按15%征收、亏损结转年限延长至10年、研发费加计扣除、地方上还有财政补助几十万到上百万。在这“春风”的关怀下，全国高新技术企业数量达18.1万家！在如此诱惑下，很多企业铤而走险，在财务数据上弄虚作假。
2019年，“伪高企”、“假高企”可能麻烦了！
2019高企认定将更严！
3月7日，广州市白云区发通知强调：加强对已认定高新技术企业和今年拟认定（包括重新认定高企）的管理。
1、对2019年申报高企认定的企业实施现场检查
将委托专业机构，委派专家组对2019年度申报高企认定的企业开展现场核查。现场核查的重点是过去三年纳税总额低于各级政府应给予的高新技术企业补贴额度的企业、实际生产经营或研发场所不在我区的企业以及过去三年纳税申报表未体现研发费的企业。
2、对已认定高企也要重点抽查，不合格就摘帽
重点抽查2017年度通过认定的高企，抽查企业数量不低于该年度认定总数的10%。抽查按不同行业、不同类型、不同体量的企业抽取，重点抽取以下四类企业：
（1）高企火炬统计年报中，研发投入占比低于高企认定要求的企业；
（2）高企火炬统计年报中，年主营收入下降高于10%的企业；
2019高企严查这6个方面！
早在2018年，国家科技部抽查了享受高新技术企业税收优惠的100家企业，竟有80家不符合条件，占比高达80%。随之而来的就是部分省份对高企实施现场检查，打破了之前只重“书面审核”，不看“企业实际”的惯例。
被查出不符合高企标准却享受了税收优惠的企业麻烦了！
高企检查主要分为认定前检查和认定后检查！
检查要点主要是这6个方面：
1、认定前“现场检查”要点
（1）看高新收入。
按照相关规定，高新技术产品（服务）收入是指企业通过研发和相关技术创新活动，取得的产品（服务）收入与技术性收入的总和。对企业取得上述收入发挥核心支持作用的技术应属于《技术领域》规定的范围。若企业在经营过程中，对自产产品或服务核心技术难以佐证和说明，想通过基本没戏了！
（2）理顺高新收入和知识产权的关系。
虽然《高新技术企业认定管理办法》规定企业通过自主研发、受让、受赠、并购等方式取得的知识产权都可计算在内，但实际评审过程中主要考虑的是“自主研发”，对于“受让”“受赠”的知识产权于公司收入的贡献度证明会做重点核查。所以，只是简单购买他人专利证书并无实际成果转化，双方也并无实际研发成果合作的“转让”，会被驳回，特别是突击申请软件著作权的非软件公司。
（3）研发费用的合理性。
尽管企业提交的资料已经包含了中介机构出具的研发费用专项审计报告，但在现场检查时，也会看企业的研发费用明细账。如果企业在会计科目中根本没有设置“研发支出”、“管理费用——研发费用”等科目，就无法证明报送的研发费用真的就是研发费用。研发费用不达标，申请高新必然会被否决。
2、认定后“税务稽查”要点
（1）“看长相”
没有科技感的公司名称，这类企业肯定吃亏，这部分企业绝大多数是经营年限已久，行业传统，以原加工贸易企业为主，它们的经营范围跟高新技术领域要求符合度很低，往往只是擦边而已，所以一旦抽中现场考察，真正的高科技元素得不到凸显，很容易被“毙”掉。
（2）“看数据”
这部分数据以税务局稽查为主，高新技术企业60%主营产品收入证明，按《高新技术企业认定管理办法》规定，高新技术企业产品收入是指企业通过研发和相关技术创新活动，取得产品（服务）收入与技术性收入的总和。
对企业取得上述收入发挥核心支持作用的技术应属于《高新技术企业八大领域》规定的范围，这一条如果严格来说，企业只是代理他人的高科技产品都不能算在内，何况从事的行业技术相对成熟，没有附加的创意研发，这一类高新技术企业产品收入证明很难站住脚，被相中否决的概率也很大。
（3）“看费用”
抽查企业的实际研发费支出时，企业财务人员的专业度和是否有建立规范的研发费用科目或研发费用台账显得尤为重要，不然很难解释每一笔研发费用支出的合理性，特别是研发费用比例处在达标线左右的企业，一旦被踢掉若干项目的费用，总额上就会因研发费用不达标而被否定。
总之，真的假不了，假的真不了！
前车之鉴！补税+滞纳金成标配！
一、优惠税率相差10个点，对上市公司影响颇大！
2018年12月18日，上市公司中装建设发布的一纸公告，引起广泛关注：
公司于2018年进行了高新技术企业的资格复审，但近日收到《关于公示深圳市2018年第三批拟认定高新技术企业名单的通知》，公司未被列入该名单，高新技术企业资格复审未获得核准，因此须补缴1月~9月所得税额约为2228.49万元，占当期归属于上市公司股东的净利润比例约为16.77%。
无独有偶，另一家上市公司全信股份须补缴1月~9月所得税额约1230万元，占当期归属于上市公司股东的净利润比例约为10.93%，同样会对公司2018年度的业绩产生一定影响。
二、“工资薪金”变“劳务费” 高新技术企业被查 ！
甲企业人为降低职工总人数，以达到享受对高新技术企业所得税优惠和少缴纳养老保险的目的。甲企业为了满足税法对高新技术企业设定的条件而弄虚作假，这样不仅存在很大的税务风险，而且很可能被取消高新技术企业资格，今后不仅享受不到税收优惠，而且企业信誉也会受到影响。
案情简介
某税务局对甲高新技术企业享受所得税优惠的情况纳税评估时发现，三年来甲公司销售额以每年20%的比例增长，所得税税负高于同行业平均水平，其他各项纳税评估指标较好。但是，甲企业所得税申报表中的“本年研发人员数”、“本年职工总数”及“本年研发人员占当年职工总数的比例”三个指标均未发生明显变化，不符合高新技术企业的经营特征，由此让税务人员产生疑惑。
通过了解得知，三年来甲企业并未增加生产设备，仅是对关键设备进行更新改造及生产技术上改进，使得生产能力有了一定幅度的提高，但不是造成甲企业生产规模大幅增加的主要原因。为此，税务人员对甲企业进行了五项实地核查，即生产计划及安排记录、员工考勤表、加班补贴表、工资支出及社会保险缴纳原始凭证、个人所得税扣缴明细表等资料。
通过核查发现两个异常情况：
一、第一个异常情况
各部门员工考勤实际人数总和大于《企业基础信息表》上的职工人数；
二、第二个异常情况
职工的社保缴纳比例远高于当地同类企业水平。再结合此前发现甲企业“劳务费用”支出数额较大等情况，税务人员判断甲企业可能将部分员工工资以劳务费的形式列入了成本费用。
原来，甲公司发现税务人员对高新技术企业往往检查是否有虚增技术人员的现象，很少检查企业职工总人数，便决定反其道而行，真实地反映技术人员数，人为降低职工总人数，这样不仅可以满足科技人员占当年职工总人数的比例不低于10%，而且还可以达到企业少缴纳养老保险金的目的。
三、案件提醒：
根据《高新技术企业认定管理工作指引》（国科发火〔2016〕195号）的相关规定，企业职工总数包括企业在职，兼职和临时聘用人员。
一般情况下，在职人员的报酬计入“工资薪金”，兼职或临时聘用人员的报酬计入“劳务费”。在职人员可以通过企业是否签订劳动合同或缴纳社会保险费来鉴别。但不管在职人员、兼职或临时聘用人员若累计工作时间满183天以上的，应归入企业的职工总数。
因此，虽然甲公司将部分员工工资以劳务费的形式列入了成本费用的方式以达到减少职工总数的目的，但根据法规的规定，甲公司以“劳务费”支付的报酬的人员，若符合累计工作时间满183天规定的，也应计入职工总数的范畴。劳务费是个坑，不是想开就能开的。
说到这里再提醒大家，对于今年的税务稽查，工资薪金是重点，与工资薪金息息相关的工资表可能存在涉税风险！
虚列人员工资，被罚30万！
一家新三板公司公布的被稽查案例：
某公司2011年账列应付工资科目为5,013,120.00元，其中列支工作人员工资2,779,470.00元，销售及相关人员工资714,500.00元，外勤人员工资1,519,150.00元。
检查发现，账列外勤人员发放的工资其中有1,211,400.00元无签字记录、转账凭证或收据等有效发放依据。对于无有效发放依据的工资属多列工资1,211,400.00元，应补缴企业所得税302,850.00元。
税务稽查的时候不仅稽查了工资表，还要去核查签字记录、银行转账、收据等。仅仅凭一张工资表就想蒙混过关，肯定是不行的！
说起高新技术企业，可谓“税之骄子”！企业所得税减按15%征收、亏损结转年限延长至10年、研发费加计扣除、地方上还有财政补助几十万到上百万。在这“春风”的关怀下，全国高新技术企业数量达18.1万家！在如此诱惑下，很多企业铤而走险，在财务数据上弄虚作假。
2019年，“伪高企”、“假高企”可能麻烦了！
2019高企认定将更严！
3月7日，广州市白云区发通知强调：加强对已认定高新技术企业和今年拟认定（包括重新认定高企）的管理。
1、对2019年申报高企认定的企业实施现场检查
将委托专业机构，委派专家组对2019年度申报高企认定的企业开展现场核查。现场核查的重点是过去三年纳税总额低于各级政府应给予的高新技术企业补贴额度的企业、实际生产经营或研发场所不在我区的企业以及过去三年纳税申报表未体现研发费的企业。
2、对已认定高企也要重点抽查，不合格就摘帽
重点抽查2017年度通过认定的高企，抽查企业数量不低于该年度认定总数的10%。抽查按不同行业、不同类型、不同体量的企业抽取，重点抽取以下四类企业：
（1）高企火炬统计年报中，研发投入占比低于高企认定要求的企业；
（2）高企火炬统计年报中，年主营收入下降高于10%的企业；
2019高企严查这6个方面！
早在2018年，国家科技部抽查了享受高新技术企业税收优惠的100家企业，竟有80家不符合条件，占比高达80%。随之而来的就是部分省份对高企实施现场检查，打破了之前只重“书面审核”，不看“企业实际”的惯例。
被查出不符合高企标准却享受了税收优惠的企业麻烦了！
高企检查主要分为认定前检查和认定后检查！
检查要点主要是这6个方面：
1、认定前“现场检查”要点
（1）看高新收入。
按照相关规定，高新技术产品（服务）收入是指企业通过研发和相关技术创新活动，取得的产品（服务）收入与技术性收入的总和。对企业取得上述收入发挥核心支持作用的技术应属于《技术领域》规定的范围。若企业在经营过程中，对自产产品或服务核心技术难以佐证和说明，想通过基本没戏了！
（2）理顺高新收入和知识产权的关系。
虽然《高新技术企业认定管理办法》规定企业通过自主研发、受让、受赠、并购等方式取得的知识产权都可计算在内，但实际评审过程中主要考虑的是“自主研发”，对于“受让”“受赠”的知识产权于公司收入的贡献度证明会做重点核查。所以，只是简单购买他人专利证书并无实际成果转化，双方也并无实际研发成果合作的“转让”，会被驳回，特别是突击申请软件著作权的非软件公司。
（3）研发费用的合理性。
尽管企业提交的资料已经包含了中介机构出具的研发费用专项审计报告，但在现场检查时，也会看企业的研发费用明细账。如果企业在会计科目中根本没有设置“研发支出”、“管理费用——研发费用”等科目，就无法证明报送的研发费用真的就是研发费用。研发费用不达标，申请高新必然会被否决。
2、认定后“税务稽查”要点
（1）“看长相”
没有科技感的公司名称，这类企业肯定吃亏，这部分企业绝大多数是经营年限已久，行业传统，以原加工贸易企业为主，它们的经营范围跟高新技术领域要求符合度很低，往往只是擦边而已，所以一旦抽中现场考察，真正的高科技元素得不到凸显，很容易被“毙”掉。
（2）“看数据”
这部分数据以税务局稽查为主，高新技术企业60%主营产品收入证明，按《高新技术企业认定管理办法》规定，高新技术企业产品收入是指企业通过研发和相关技术创新活动，取得产品（服务）收入与技术性收入的总和。
对企业取得上述收入发挥核心支持作用的技术应属于《高新技术企业八大领域》规定的范围，这一条如果严格来说，企业只是代理他人的高科技产品都不能算在内，何况从事的行业技术相对成熟，没有附加的创意研发，这一类高新技术企业产品收入证明很难站住脚，被相中否决的概率也很大。
（3）“看费用”
抽查企业的实际研发费支出时，企业财务人员的专业度和是否有建立规范的研发费用科目或研发费用台账显得尤为重要，不然很难解释每一笔研发费用支出的合理性，特别是研发费用比例处在达标线左右的企业，一旦被踢掉若干项目的费用，总额上就会因研发费用不达标而被否定。
总之，真的假不了，假的真不了！
前车之鉴！补税+滞纳金成标配！
一、优惠税率相差10个点，对上市公司影响颇大！
2018年12月18日，上市公司中装建设发布的一纸公告，引起广泛关注：
公司于2018年进行了高新技术企业的资格复审，但近日收到《关于公示深圳市2018年第三批拟认定高新技术企业名单的通知》，公司未被列入该名单，高新技术企业资格复审未获得核准，因此须补缴1月~9月所得税额约为2228.49万元，占当期归属于上市公司股东的净利润比例约为16.77%。
无独有偶，另一家上市公司全信股份须补缴1月~9月所得税额约1230万元，占当期归属于上市公司股东的净利润比例约为10.93%，同样会对公司2018年度的业绩产生一定影响。
二、“工资薪金”变“劳务费” 高新技术企业被查 ！
甲企业人为降低职工总人数，以达到享受对高新技术企业所得税优惠和少缴纳养老保险的目的。甲企业为了满足税法对高新技术企业设定的条件而弄虚作假，这样不仅存在很大的税务风险，而且很可能被取消高新技术企业资格，今后不仅享受不到税收优惠，而且企业信誉也会受到影响。
案情简介
某税务局对甲高新技术企业享受所得税优惠的情况纳税评估时发现，三年来甲公司销售额以每年20%的比例增长，所得税税负高于同行业平均水平，其他各项纳税评估指标较好。但是，甲企业所得税申报表中的“本年研发人员数”、“本年职工总数”及“本年研发人员占当年职工总数的比例”三个指标均未发生明显变化，不符合高新技术企业的经营特征，由此让税务人员产生疑惑。
通过了解得知，三年来甲企业并未增加生产设备，仅是对关键设备进行更新改造及生产技术上改进，使得生产能力有了一定幅度的提高，但不是造成甲企业生产规模大幅增加的主要原因。为此，税务人员对甲企业进行了五项实地核查，即生产计划及安排记录、员工考勤表、加班补贴表、工资支出及社会保险缴纳原始凭证、个人所得税扣缴明细表等资料。
通过核查发现两个异常情况：
一、第一个异常情况
各部门员工考勤实际人数总和大于《企业基础信息表》上的职工人数；
二、第二个异常情况
职工的社保缴纳比例远高于当地同类企业水平。再结合此前发现甲企业“劳务费用”支出数额较大等情况，税务人员判断甲企业可能将部分员工工资以劳务费的形式列入了成本费用。
原来，甲公司发现税务人员对高新技术企业往往检查是否有虚增技术人员的现象，很少检查企业职工总人数，便决定反其道而行，真实地反映技术人员数，人为降低职工总人数，这样不仅可以满足科技人员占当年职工总人数的比例不低于10%，而且还可以达到企业少缴纳养老保险金的目的。
三、案件提醒：
根据《高新技术企业认定管理工作指引》（国科发火〔2016〕195号）的相关规定，企业职工总数包括企业在职，兼职和临时聘用人员。
一般情况下，在职人员的报酬计入“工资薪金”，兼职或临时聘用人员的报酬计入“劳务费”。在职人员可以通过企业是否签订劳动合同或缴纳社会保险费来鉴别。但不管在职人员、兼职或临时聘用人员若累计工作时间满183天以上的，应归入企业的职工总数。
因此，虽然甲公司将部分员工工资以劳务费的形式列入了成本费用的方式以达到减少职工总数的目的，但根据法规的规定，甲公司以“劳务费”支付的报酬的人员，若符合累计工作时间满183天规定的，也应计入职工总数的范畴。劳务费是个坑，不是想开就能开的。
说到这里再提醒大家，对于今年的税务稽查，工资薪金是重点，与工资薪金息息相关的工资表可能存在涉税风险！
虚列人员工资，被罚30万！
一家新三板公司公布的被稽查案例：
某公司2011年账列应付工资科目为5,013,120.00元，其中列支工作人员工资2,779,470.00元，销售及相关人员工资714,500.00元，外勤人员工资1,519,150.00元。
检查发现，账列外勤人员发放的工资其中有1,211,400.00元无签字记录、转账凭证或收据等有效发放依据。对于无有效发放依据的工资属多列工资1,211,400.00元，应补缴企业所得税302,850.00元。
税务稽查的时候不仅稽查了工资表，还要去核查签字记录、银行转账、收据等。仅仅凭一张工资表就想蒙混过关，肯定是不行的！
大家好,我是你们的科普达人小V，上一期我们主要讲细胞凋亡TUNEL的检测方法和实验操作注意点，这次我们来唠一唠凋亡检测的另一个大头——Annexin V法流式凋亡检测。
我们先来回忆一下上期中讲的Annexin V凋亡检测原理：
凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）会从膜内翻到膜外，这是凋亡的一个典型特征，细胞凋亡处于早期阶段时，仅有PS外翻，而细胞膜仍然完整，随着凋亡进程的推移，细胞除了PS外翻以外，细胞膜通透性会改变，可以简单的理解成凋亡后期，细胞膜有穿孔的现象。
接下来我们再来看一下试剂，我们以最常见的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例，试剂盒内一般都是3个组分：两个染料，再加一个为Annexin V标记提供钙离子环境的Binding Buffer。Annexin V本质是一个在钙离子环境下，能够与磷脂酰丝氨酸高度特异性结合的膜联蛋白，通过在该蛋白上标记的荧光基团，我们就可以标记凋亡细胞了，然后再搭配只能够进入受损细胞膜的核酸染料，就可以达到区分各阶段细胞的目的了。
我们将细胞分为三类：一是无PS外翻，也没有细胞膜破裂的健康细胞（两个染料都染不上），二是处于早期凋亡，有PS外翻但是细胞膜完好的细胞（可以染上Annexin V-FITC,不能够染上PI），三是处于晚期凋亡阶段，既存在PS外翻，也存在细胞膜破裂的晚期凋亡细胞（两种染料均可染上），第四类较为特殊，不做赘述，它是无PS外翻但是细胞膜受损的细胞，一般认为这是坏死细胞（可以染上PI，但是无法染上Annexin V-FITC）。
染完色后通过流式细胞仪，我们就能够对细胞群体进行定量和分析了。
以上就是Annexin V法检测凋亡的原理，怎么样是不是超简单~接下来我们来看一下这个实验本身，如何顺利的攻克这个检测呢？
硬核技术一：
细胞收集与染色——如何规范化操作？
Annexin V法的检测主体是流式细胞仪，因此样品必须处理成悬浮细胞的形式才可以上机检测。如果是细胞样品，悬浮细胞直接计数，贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化成细胞悬液后进行后续操作；如果样本是组织，那么需要将其消化成细胞悬液才可以进行后续的实验步骤。
染色操作就非常的简单了，可以概括成以下几步：
（1） 细胞收集，PBS洗涤
（2） Binding Buffer重悬
（3） 染色
（4） 流式检测
一般建议大家收集105个细胞进入洗涤、染色步骤，洗涤时用预冷的PBS洗两遍，然后将PBS吸干净，用Binding Buffer重悬后进行染色，染色时两种染料各加5 µl，避光染色10 min即可终止。
这里要特别提醒一下大家，染色时间不建议延长，避免造成假阳性影响实验结果分析。
硬核技术二：
实验设计——我该拿这么多对照组怎么办？
流式的对照一直很令人头疼，今天小V就来为大家解答一下疑惑。
流式上机除了实验组的双染组之外，还需要添加一系列的对照，用于仪器荧光补偿的调整和后续的数据分析。我们可以将这些对照分为3类。
（1） 空白对照：不进行标记的裸细胞，一般选用待测实验组细胞。目的是看经处理后，细胞本身物理状态是否有变化，也用以进行细胞选群和阴性细胞大致位置的确定。
（2） 阴性对照：双染的不处理正常细胞，目的是排除细胞自身凋亡以及因操作过程带来的凋亡和坏死。另外，健康细胞分界线确定建议用这个对照，因为双染健康细胞相对于不染健康细胞会存在一定的荧光偏移。
（3） 单标组：单一染料标记的实验组细胞（有凋亡细胞）。这一个组别主要是用来进行荧光补偿的调节。流式检测中，荧光信号除了接收通道以外，还可能被另一通道接收到，影响该通道的数据，因此需要进行“补偿调节”，扣除该染料对其他荧光通道的影响。单标组有几种染料就应该做几管，所使用样本应该是该染料检测时，细胞能够有明显区分度的样本。
硬核技术三：
数据分析——救救孩子，怎么搞分析啊？
流式数据的分析是这个实验的重中之重了，我们应该如何操作，才能够得到漂亮的图呢？
首先，我们来认识一下流式分析的检测原理：流式细胞仪通道中一个个的样本流过，仪器会给它一个激发光，这个样本给出的发射光被流式的不同通道所接收，反映在图上就是下图所示的一个个小点（smooth图不以小点的形式显示），这边需要强调的是，流式通道一个个通过去的样品，不一定全是细胞，体系内的细胞碎片，各种小分子杂质只要能够被流式检测到，反映在图谱上，就是一个点。所以严格来说，流式图谱中的点，每个点代表的是一个事件。一般分析我们建议上机时至少采集10000个事件，我们认为这个是能够满足统计学样本分析量的基本要求的。
凋亡数据分析有三个重要步骤：画门、调补偿、画十字门。
1、画门
流式分析给出的第一个图谱，是FSC-SSC物理图谱（图a），这边是小V做的一个凋亡细胞样品，使用 Vazyme #A211 Annexin V-FITC/PI染色，上机分析。首先得到的是图a的FSC-SSC物理图谱，这是之后所有分析的基础。
横纵坐标轴FSC（前向角散射）和SSC（侧向角散射）分别代表了细胞大小和细胞颗粒度，通过这个图谱，我们能根据细胞大小、颗粒度做一个分类。这个分类有两个作用，一是如果两种细胞群在一起，细胞有明显的形态区别，可以做初步的分类，另一个重要作用是可以区分细胞与细胞碎片，如图a所示，我们能够看到很明显的两个群，右上方一群，左下角有一群大小和颗粒度都非常低的事件群体，这一群与右上群体具有明显区分度的事件，被判定为细胞碎片，是必须在后续分析中排除出去的。
为什么一定要出去细胞碎片再进行后续分析呢？
大家可以看图b和图d，图b是图a中所有事件全部划入后续分析得到的结果，图d是把图c中的细胞碎片排除以后进行分析得到的结果。很明显图d的分群比图b优秀太多，细胞碎片真的是一个及其影响分群的东西。
小V要专门另起一行来跟大家强调一下：细胞碎片，请尽力把它排除出你的分析范围！！！
好了，告一段落，搞定了基础的FSC-SSC图谱，成功选到了我们要分析的细胞，也就是做好了第一步：画门。我们接下来应该做什么呢？
2、调补偿
现在的流式细胞仪，调补偿的方法各有不同，有直接上机的时候跑个单染管，仪器自动给你调整好的，也有仪器万事不管，你自己跑完所有样本，回头吭哧吭哧自己做调节的。前者我们就不讲了，我们来讲一讲后者。
首先，必须调节补偿，细胞被激发出来的荧光除了被你设置的那个接收通道接收以外，还有一部分光会逸散到其他通道当中。用FITC作为例子，大家可以看下边这个表格：目标接收通道FL1只能接收到80 %的光，还有20 %散布在其他通道，FL2通道高达10 %，因此不扣除这部分荧光，对你数据分析的影响是非常大的。这个扣除某一荧光素误入到其他荧光通道中的信号的操作，就叫做“调节荧光补偿”。
实验中用到几种荧光，就要准备几种单染管！！
唠完前边这些理论内容，我们来说点实在的。在凋亡实验中，我们如何来调节荧光补偿呢？
这边小V推荐大家拿到原始数据以后，用Flowjo V10进行荧光补偿的调节，软件自动，不用发愁～这个操作分为3步
（1） 在FSC-SSC图中，选出待分析细胞群，一定尽量扔掉细胞碎片！
（2） 打开Flowjo的补偿调节界面，按需选择样品、阴性、阳性。Positive一般软件会自动选择，大家不用在意，请重点关注Sample和Negative，Sample是你的单染管，Negative指的是不含该染料的体系，一般统一用不染色的对照组就行了。
（3） 请点击Apply to Group按钮，选中对应的数据组，简单模式的你的补偿就已经OK了~
3、画十字门
最后呢我们来唠一下关于结果怎么看的那些事儿~
我们通过十字门，将细胞分为了四个象限（见图4），分别对应了四种不同的染色情况，左下象限是两个染料都没染到的健康细胞，右下是染上了Annexin V-FITC，没染上PI的早期凋亡细胞，右上象限我们一般情况下把它判定为晚期凋亡细胞（FITC和PI都能染上），但实际情况中，右上象限也是包括了一部分坏死细胞的，但是比例比较小，一般是忽略掉的。左上象限是坏死细胞（不经凋亡，因此没有PS外翻，但是细胞坏死后细胞膜损坏，因此核酸染料可以进入）。
讲完了结果的四个象限划分，我们回到四个象限本身，这个十字门该怎么画呢？
这边小V给到大家一个最优的画法~大家可以掏出你调节好补偿的数据，找出两个单染组，然后根据单染组的分群大致画出横纵坐标轴的荧光强度分界，然后在双染的数据中以这两个分界为基准，结合数据的实际分群情况进行微调，就是属于你数据的十字门了~这边也是强调一下，需要一起分析的数据们，都必须用统一的十字门哟！
最后，有几个点需要补充说明一下，也是大家经常遇到的一些问题：
1. 我的细胞贴壁非常的厉害，不含EDTA胰酶我都得消化个15、20分钟，怎么办？
遇到这种情况，小V建议你两害相权取其轻，Binding Buffer里最重要的组分是钙离子，建议大家用不含EDTA的胰酶是因为EDTA螯合剂会把钙离子扯下来，降低Annexin V的标记效率。但是如果消化要花费15分钟甚至更久，会引入很多机械性损伤，对于数据分析有很大的影响。所以这种时候用含EDTA的胰酶也是可以的，但是后续一定要洗涤干净。
2. 我能不能延长染色时间啊？我觉得10分钟染色，好像染得不够多啊？
不可以的哦，10分钟是最优化的染色时间，染色时间过长的情况下会产生假阳性，不利于真实的实验结果分析。
3. 我的细胞因为种种原因，就是没办法好好分群，我该怎么画门呢？
这里首先要同情一下这位同学，然后要告诉大家，遇到这种情况，可做一个健康细胞双染（同一份健康细胞，加染料与不加染料，其本底荧光值会有偏移，因此这边必须进行双染），健康细胞肯定是染不上染料的，那么你就得到了一团在左下角的细胞，以一团细胞的边界为标准画十字门，然后统一用这个十字门就可以了。
4. 我这边没有流式，我该在哪里停止实验啊？
收集好细胞后，经PBS洗涤并用Binding Buffer重悬，放置在冰上去平台处染色然后上机即可。中间时间不宜过长，否则细胞状态容易变差。
友情提醒：如果细胞本身凋亡就非常多，那么转移过程可能导致细胞状态急速变差。因此需要根据细胞本身特性和药物处理后细胞状态进行综合判断，建议针对不同实验条件开展优化。
好啦~今天的课小V就讲到这里了，如果大家在实验方面有任何疑问， 欢迎随时咨询小V，或直接联系您身边的诺唯赞人，我们将努力为您提供更优质的产品和服务！最后，祝福大家实验顺当结果好，细胞超乖不作妖！
我们先来回忆一下上期中讲的Annexin V凋亡检测原理：
凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）会从膜内翻到膜外，这是凋亡的一个典型特征，细胞凋亡处于早期阶段时，仅有PS外翻，而细胞膜仍然完整，随着凋亡进程的推移，细胞除了PS外翻以外，细胞膜通透性会改变，可以简单的理解成凋亡后期，细胞膜有穿孔的现象。
接下来我们再来看一下试剂，我们以最常见的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例，试剂盒内一般都是3个组分：两个染料，再加一个为Annexin V标记提供钙离子环境的Binding Buffer。Annexin V本质是一个在钙离子环境下，能够与磷脂酰丝氨酸高度特异性结合的膜联蛋白，通过在该蛋白上标记的荧光基团，我们就可以标记凋亡细胞了，然后再搭配只能够进入受损细胞膜的核酸染料，就可以达到区分各阶段细胞的目的了。
我们将细胞分为三类：一是无PS外翻，也没有细胞膜破裂的健康细胞（两个染料都染不上），二是处于早期凋亡，有PS外翻但是细胞膜完好的细胞（可以染上Annexin V-FITC,不能够染上PI），三是处于晚期凋亡阶段，既存在PS外翻，也存在细胞膜破裂的晚期凋亡细胞（两种染料均可染上），第四类较为特殊，不做赘述，它是无PS外翻但是细胞膜受损的细胞，一般认为这是坏死细胞（可以染上PI，但是无法染上Annexin V-FITC）。
染完色后通过流式细胞仪，我们就能够对细胞群体进行定量和分析了。
以上就是Annexin V法检测凋亡的原理，怎么样是不是超简单~接下来我们来看一下这个实验本身，如何顺利的攻克这个检测呢？
硬核技术一：
细胞收集与染色——如何规范化操作？
Annexin V法的检测主体是流式细胞仪，因此样品必须处理成悬浮细胞的形式才可以上机检测。如果是细胞样品，悬浮细胞直接计数，贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化成细胞悬液后进行后续操作；如果样本是组织，那么需要将其消化成细胞悬液才可以进行后续的实验步骤。
染色操作就非常的简单了，可以概括成以下几步：
（1） 细胞收集，PBS洗涤
（2） Binding Buffer重悬
（3） 染色
（4） 流式检测
一般建议大家收集105个细胞进入洗涤、染色步骤，洗涤时用预冷的PBS洗两遍，然后将PBS吸干净，用Binding Buffer重悬后进行染色，染色时两种染料各加5 µl，避光染色10 min即可终止。
这里要特别提醒一下大家，染色时间不建议延长，避免造成假阳性影响实验结果分析。
硬核技术二：
实验设计——我该拿这么多对照组怎么办？
流式的对照一直很令人头疼，今天小V就来为大家解答一下疑惑。
流式上机除了实验组的双染组之外，还需要添加一系列的对照，用于仪器荧光补偿的调整和后续的数据分析。我们可以将这些对照分为3类。
（1） 空白对照：不进行标记的裸细胞，一般选用待测实验组细胞。目的是看经处理后，细胞本身物理状态是否有变化，也用以进行细胞选群和阴性细胞大致位置的确定。
（2） 阴性对照：双染的不处理正常细胞，目的是排除细胞自身凋亡以及因操作过程带来的凋亡和坏死。另外，健康细胞分界线确定建议用这个对照，因为双染健康细胞相对于不染健康细胞会存在一定的荧光偏移。
（3） 单标组：单一染料标记的实验组细胞（有凋亡细胞）。这一个组别主要是用来进行荧光补偿的调节。流式检测中，荧光信号除了接收通道以外，还可能被另一通道接收到，影响该通道的数据，因此需要进行“补偿调节”，扣除该染料对其他荧光通道的影响。单标组有几种染料就应该做几管，所使用样本应该是该染料检测时，细胞能够有明显区分度的样本。
硬核技术三：
数据分析——救救孩子，怎么搞分析啊？
流式数据的分析是这个实验的重中之重了，我们应该如何操作，才能够得到漂亮的图呢？
首先，我们来认识一下流式分析的检测原理：流式细胞仪通道中一个个的样本流过，仪器会给它一个激发光，这个样本给出的发射光被流式的不同通道所接收，反映在图上就是下图所示的一个个小点（smooth图不以小点的形式显示），这边需要强调的是，流式通道一个个通过去的样品，不一定全是细胞，体系内的细胞碎片，各种小分子杂质只要能够被流式检测到，反映在图谱上，就是一个点。所以严格来说，流式图谱中的点，每个点代表的是一个事件。一般分析我们建议上机时至少采集10000个事件，我们认为这个是能够满足统计学样本分析量的基本要求的。
凋亡数据分析有三个重要步骤：画门、调补偿、画十字门。
1、画门
流式分析给出的第一个图谱，是FSC-SSC物理图谱（图a），这边是小V做的一个凋亡细胞样品，使用 Vazyme #A211 Annexin V-FITC/PI染色，上机分析。首先得到的是图a的FSC-SSC物理图谱，这是之后所有分析的基础。
横纵坐标轴FSC（前向角散射）和SSC（侧向角散射）分别代表了细胞大小和细胞颗粒度，通过这个图谱，我们能根据细胞大小、颗粒度做一个分类。这个分类有两个作用，一是如果两种细胞群在一起，细胞有明显的形态区别，可以做初步的分类，另一个重要作用是可以区分细胞与细胞碎片，如图a所示，我们能够看到很明显的两个群，右上方一群，左下角有一群大小和颗粒度都非常低的事件群体，这一群与右上群体具有明显区分度的事件，被判定为细胞碎片，是必须在后续分析中排除出去的。
为什么一定要出去细胞碎片再进行后续分析呢？
大家可以看图b和图d，图b是图a中所有事件全部划入后续分析得到的结果，图d是把图c中的细胞碎片排除以后进行分析得到的结果。很明显图d的分群比图b优秀太多，细胞碎片真的是一个及其影响分群的东西。
小V要专门另起一行来跟大家强调一下：细胞碎片，请尽力把它排除出你的分析范围！！！
好了，告一段落，搞定了基础的FSC-SSC图谱，成功选到了我们要分析的细胞，也就是做好了第一步：画门。我们接下来应该做什么呢？
2、调补偿
现在的流式细胞仪，调补偿的方法各有不同，有直接上机的时候跑个单染管，仪器自动给你调整好的，也有仪器万事不管，你自己跑完所有样本，回头吭哧吭哧自己做调节的。前者我们就不讲了，我们来讲一讲后者。
首先，必须调节补偿，细胞被激发出来的荧光除了被你设置的那个接收通道接收以外，还有一部分光会逸散到其他通道当中。用FITC作为例子，大家可以看下边这个表格：目标接收通道FL1只能接收到80 %的光，还有20 %散布在其他通道，FL2通道高达10 %，因此不扣除这部分荧光，对你数据分析的影响是非常大的。这个扣除某一荧光素误入到其他荧光通道中的信号的操作，就叫做“调节荧光补偿”。
实验中用到几种荧光，就要准备几种单染管！！
唠完前边这些理论内容，我们来说点实在的。在凋亡实验中，我们如何来调节荧光补偿呢？
这边小V推荐大家拿到原始数据以后，用Flowjo V10进行荧光补偿的调节，软件自动，不用发愁～这个操作分为3步
（1） 在FSC-SSC图中，选出待分析细胞群，一定尽量扔掉细胞碎片！
（2） 打开Flowjo的补偿调节界面，按需选择样品、阴性、阳性。Positive一般软件会自动选择，大家不用在意，请重点关注Sample和Negative，Sample是你的单染管，Negative指的是不含该染料的体系，一般统一用不染色的对照组就行了。
（3） 请点击Apply to Group按钮，选中对应的数据组，简单模式的你的补偿就已经OK了~
3、画十字门
最后呢我们来唠一下关于结果怎么看的那些事儿~
我们通过十字门，将细胞分为了四个象限（见图4），分别对应了四种不同的染色情况，左下象限是两个染料都没染到的健康细胞，右下是染上了Annexin V-FITC，没染上PI的早期凋亡细胞，右上象限我们一般情况下把它判定为晚期凋亡细胞（FITC和PI都能染上），但实际情况中，右上象限也是包括了一部分坏死细胞的，但是比例比较小，一般是忽略掉的。左上象限是坏死细胞（不经凋亡，因此没有PS外翻，但是细胞坏死后细胞膜损坏，因此核酸染料可以进入）。
讲完了结果的四个象限划分，我们回到四个象限本身，这个十字门该怎么画呢？
这边小V给到大家一个最优的画法~大家可以掏出你调节好补偿的数据，找出两个单染组，然后根据单染组的分群大致画出横纵坐标轴的荧光强度分界，然后在双染的数据中以这两个分界为基准，结合数据的实际分群情况进行微调，就是属于你数据的十字门了~这边也是强调一下，需要一起分析的数据们，都必须用统一的十字门哟！
最后，有几个点需要补充说明一下，也是大家经常遇到的一些问题：
1. 我的细胞贴壁非常的厉害，不含EDTA胰酶我都得消化个15、20分钟，怎么办？
遇到这种情况，小V建议你两害相权取其轻，Binding Buffer里最重要的组分是钙离子，建议大家用不含EDTA的胰酶是因为EDTA螯合剂会把钙离子扯下来，降低Annexin V的标记效率。但是如果消化要花费15分钟甚至更久，会引入很多机械性损伤，对于数据分析有很大的影响。所以这种时候用含EDTA的胰酶也是可以的，但是后续一定要洗涤干净。
2. 我能不能延长染色时间啊？我觉得10分钟染色，好像染得不够多啊？
不可以的哦，10分钟是最优化的染色时间，染色时间过长的情况下会产生假阳性，不利于真实的实验结果分析。
3. 我的细胞因为种种原因，就是没办法好好分群，我该怎么画门呢？
这里首先要同情一下这位同学，然后要告诉大家，遇到这种情况，可做一个健康细胞双染（同一份健康细胞，加染料与不加染料，其本底荧光值会有偏移，因此这边必须进行双染），健康细胞肯定是染不上染料的，那么你就得到了一团在左下角的细胞，以一团细胞的边界为标准画十字门，然后统一用这个十字门就可以了。
4. 我这边没有流式，我该在哪里停止实验啊？
收集好细胞后，经PBS洗涤并用Binding Buffer重悬，放置在冰上去平台处染色然后上机即可。中间时间不宜过长，否则细胞状态容易变差。
友情提醒：如果细胞本身凋亡就非常多，那么转移过程可能导致细胞状态急速变差。因此需要根据细胞本身特性和药物处理后细胞状态进行综合判断，建议针对不同实验条件开展优化。
好啦~今天的课小V就讲到这里了，如果大家在实验方面有任何疑问， 欢迎随时咨询小V，或直接联系您身边的诺唯赞人，我们将努力为您提供更优质的产品和服务！最后，祝福大家实验顺当结果好，细胞超乖不作妖！
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