赏析 | Air Jordan 1 High OG 「Rebellionaire」
整体采用黑灰主色，外观酷似经典「Shadow」配色，后跟醒目的红色 “X” 油漆涂鸦，强调禁穿主题。
鞋身满印「They can’t stop you from wearing them（他们不能阻止你穿上这鞋）」字样，传承禁穿的叛逆与张扬个性的核心精神。
#xsneaker发售##Xsneaker#
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【被前任传染艾滋，她却逆风翻盘，奇迹般痊愈了】
艾滋病的治疗非常棘手，是人类遇到的最无解疾病之一。感染艾滋病病毒（HIV）后，人类的免疫系统会被逐渐摧毁，最后丧失所有免疫力死去。现在已经有药物可以控制病毒进展，阻止免疫系统的崩溃，但还达不到彻底治愈的目的。
就在几天前，顶级医学期刊《内科学年鉴》报道了一个神奇病例，给人类攻克艾滋病带来了曙光。
世界上又出现了一例可能治愈的艾滋病患者，还非常可能是「自愈」的。
大发现已经够惊人了，而更有意思的是，在步步前行的研究过程里，居然还并行了一段惊心动魄的故事？
今天我们就来讲一讲，全球第四例治愈的艾滋病例和这其中的曲曲折折。
一、天降之灾
2013 年 5 月，阿根廷的小镇埃斯佩拉萨。
一个 22 岁的姑娘遭遇了晴天霹雳，她的男友检测出了 HIV 感染。性传播是 HIV 病毒的主要传播方式之一，男友的感染很可能让姑娘无辜中招了。
没办法，姑娘只能立刻去做检查（此前她做过检查知道是 HIV 阴性）。结果是令人绝望的，她被男友传染了 HIV 病毒，检查结果呈阳性（检测是针对 HIV 血液抗体的检查，阳性就意味着 HIV 病毒来过了）。
让男友变成前男友很简单，但清除 HIV 病毒就没有那么容易了。
2013 年，艾滋病治疗已经进入了「可控阶段」，简单说就是药物可以把病毒控制在非常不活跃的状态，阻止它们破坏免疫系统。
但 HIV 的厉害之处在于，它能躲进身体细胞中形成的「病毒储存库」，让药物不能完全清除掉自己。于是免不了长期用药，需要忍受漫长的治疗痛苦。
男友不靠谱 + 艾滋病，这对姑娘来说真是天降灾难。然而，就在她崩溃无奈之际，一件超出所有人预料的事情发生了。
治疗之前需要进一步检查病毒载量，也就是详细评估体内的 HIV 病毒到了什么程度。传染给她的男友检查数值就是 186000 拷贝/mL 的高水平。
而这姑娘的病毒载量结果居然是「测不出」？！
医生也对这一结果感到惊奇。
他们先从仪器上找了原因。病毒检测有灵敏度的不同，不同的仪器能识别到的最低病毒不一样。首次检测所用仪器只能测量到 50 拷贝/ml 以上的病毒量。说不定是病毒水平较低，仪器还测不出来吧。
因为病毒数不达标，医生只能延缓抗病毒药物治疗，建议姑娘持续检测，等到指标变高再看。
奇怪的事情发生了。后来姑娘连续进行了好几次检查，居然每次都是「测不出」。
为了排除外部因素干扰，医生甚至在 2016 年特意更换了更加灵敏的仪器为她检查。在灵敏度可以到 40 拷贝/ml 的检测下，还是一样测不到。
难道说这个姑娘真的有什么特别的超能力，居然能抵抗艾滋病毒？
在没有经过药物治疗的情况下，姑娘的 HIV 感染就这么呈现出一种冬眠状态。平时的身体也非常健康，没有出现任何免疫系统受损的表现，免疫系统相关细胞检测水平也正常。
这到底是怎么一回事？
二、集结！抵御艾滋的超能力联盟
时间到了 2017 年，姑娘的医生参加了一次学术会议，一下子打开了思路。
在这里，他碰到了类似的病例。医学上把他们称之为「艾滋病精英控制者」，也就是说，有一群人生来就有控制 HIV 病毒的「超能力」。
他们人数极少，不到 HIV 感染者的 0.5%。与生俱来就能依靠自己的免疫系统初步控制病毒。当然也跟药物治疗结果一样，初步控制后的病毒还是呆在病毒储存库中，虽然量很低很难检测到，但是隐患犹存。
来自麻省理工学院的 Xu Yu 团队一直关注着他们，希望从这些「精英控制者」身上找到艾滋病的治疗密码。他们采用了更先进的技术逐一分析精英控制者的细胞，通过病毒基因测序，把常规检测不好找到的微量病毒也找出来，看看是不是有所不同。
讲到这里你应该就明白了，姑娘显然也是「精英控制者」的一员，天生拥有初步抵抗 HIV 病毒的能力。从 2017 年起，姑娘正式加入了这个联盟，和近百位「精英控制者」一起，不断接受细胞级别的检测。
这一检查可了不得，姑娘居然是近百位控制者里的特殊案例。
在详细的细胞级别检测中，其他的精英控制者都能在数以十亿计的细胞中找到不少活着的病毒或者是病毒几乎完整的尸体。但是姑娘初步检查了几亿细胞都没有完整活着的病毒，连相对完整的尸体都没有，只有几个病毒「尸块」。
类比一下，她的地位相当于精英中的精英，复联里的灭霸！没打响指，HIV 病毒就活不下去了。
检测中只发现了只一段还算相对完整的病毒序列。也正是这段序列告诉我们，姑娘身体内确实发生过 HIV 病毒的复制。她是真的彻彻底底感染之后，然后自己又干掉了病毒。
一边是越检测越高兴，姑娘很可能会成为艾滋病研究的新希望。另一边，毕竟检测都说姑娘没啥事儿了，她的生活也迈入了正轨，认识了新伴侣。
然后，她怀孕了。为了万无一失，她第一次在孕期接受了 6 个月的抗病毒药物治疗（对于普通的 HIV 感染者来说，这种方式是阻断母婴传播的绝佳手段）。
2020 年 3 月，姑娘成功生下了一个宝宝。
赶在因为新冠疫情阿根廷全境封锁的前夕，研究人员连夜检测了她的胎盘，结果同样让人兴奋。胎盘完全没有一点儿 HIV 病毒痕迹，也就是说，这个新生儿完完全全是个健康宝宝。
生育之后，细胞级别的检测还在继续，到今天为止，已经检测了姑娘身体内 11.88 亿个细胞，还是没有任何活跃病毒迹象。
也许，艾滋病真的已经「自愈」了。
三、也许我们将迎来艾滋病治愈的希望
姑娘算是第 4 个治愈艾滋病的患者。
在此之前，医学界发现了柏林病人和伦敦病人。他们的情况都非常特殊，在患有艾滋病的同时，患上了血液系统肿瘤，进行造血干细胞移植之后治愈了艾滋病。治愈可能既跟造血干细胞移植有关，也跟血液肿瘤有关。他们之后科学家做了很多复现的努力，都没能取得成功。
「艾滋病精英控制者」则是另一条路径，更多靠的是患者自身的「天赋」。2020 年，Xu Yu 团队就曾公布了一例治愈的旧金山病人，同样出自这次大规模的精英控制者筛查。只是旧金山病人的既往治疗信息还待更具体公开。
我们还不能说，发现病例就等于拿到了艾滋病治疗的钥匙。但这的的确确给治疗提供了良好的思路。
这些人体内可能存在特定的杀伤性 T 细胞应答机制。如果扩大寻找范围，检查更多精英控制者，还有可能找到其他治愈者。分析这些患者，发现背后的免疫机制，让更多艾滋病患者的免疫系统复现这种应答方式。
那么也许真的能有一天，我们真的能把艾滋病治好。
这个姑娘被研究者用地名称呼叫做「埃斯佩拉萨（西班牙语：希望）」。根据她的意愿，隐私被保护得很好。
她依然在继续参加医学研究，经历被记录进了顶级医学期刊，成为世界瞩目的焦点。
宝宝很健康，现在的伴侣也很健康，她完全摆脱了那场天降之灾的阴影，进入人生的新阶段，正在期待自己的第二个宝宝降生。
不过这一切，她的前男友都不知道。
2017 年，他因艾滋病去世了。
艾滋病的治疗非常棘手，是人类遇到的最无解疾病之一。感染艾滋病病毒（HIV）后，人类的免疫系统会被逐渐摧毁，最后丧失所有免疫力死去。现在已经有药物可以控制病毒进展，阻止免疫系统的崩溃，但还达不到彻底治愈的目的。
就在几天前，顶级医学期刊《内科学年鉴》报道了一个神奇病例，给人类攻克艾滋病带来了曙光。
世界上又出现了一例可能治愈的艾滋病患者，还非常可能是「自愈」的。
大发现已经够惊人了，而更有意思的是，在步步前行的研究过程里，居然还并行了一段惊心动魄的故事？
今天我们就来讲一讲，全球第四例治愈的艾滋病例和这其中的曲曲折折。
一、天降之灾
2013 年 5 月，阿根廷的小镇埃斯佩拉萨。
一个 22 岁的姑娘遭遇了晴天霹雳，她的男友检测出了 HIV 感染。性传播是 HIV 病毒的主要传播方式之一，男友的感染很可能让姑娘无辜中招了。
没办法，姑娘只能立刻去做检查（此前她做过检查知道是 HIV 阴性）。结果是令人绝望的，她被男友传染了 HIV 病毒，检查结果呈阳性（检测是针对 HIV 血液抗体的检查，阳性就意味着 HIV 病毒来过了）。
让男友变成前男友很简单，但清除 HIV 病毒就没有那么容易了。
2013 年，艾滋病治疗已经进入了「可控阶段」，简单说就是药物可以把病毒控制在非常不活跃的状态，阻止它们破坏免疫系统。
但 HIV 的厉害之处在于，它能躲进身体细胞中形成的「病毒储存库」，让药物不能完全清除掉自己。于是免不了长期用药，需要忍受漫长的治疗痛苦。
男友不靠谱 + 艾滋病，这对姑娘来说真是天降灾难。然而，就在她崩溃无奈之际，一件超出所有人预料的事情发生了。
治疗之前需要进一步检查病毒载量，也就是详细评估体内的 HIV 病毒到了什么程度。传染给她的男友检查数值就是 186000 拷贝/mL 的高水平。
而这姑娘的病毒载量结果居然是「测不出」？！
医生也对这一结果感到惊奇。
他们先从仪器上找了原因。病毒检测有灵敏度的不同，不同的仪器能识别到的最低病毒不一样。首次检测所用仪器只能测量到 50 拷贝/ml 以上的病毒量。说不定是病毒水平较低，仪器还测不出来吧。
因为病毒数不达标，医生只能延缓抗病毒药物治疗，建议姑娘持续检测，等到指标变高再看。
奇怪的事情发生了。后来姑娘连续进行了好几次检查，居然每次都是「测不出」。
为了排除外部因素干扰，医生甚至在 2016 年特意更换了更加灵敏的仪器为她检查。在灵敏度可以到 40 拷贝/ml 的检测下，还是一样测不到。
难道说这个姑娘真的有什么特别的超能力，居然能抵抗艾滋病毒？
在没有经过药物治疗的情况下，姑娘的 HIV 感染就这么呈现出一种冬眠状态。平时的身体也非常健康，没有出现任何免疫系统受损的表现，免疫系统相关细胞检测水平也正常。
这到底是怎么一回事？
二、集结！抵御艾滋的超能力联盟
时间到了 2017 年，姑娘的医生参加了一次学术会议，一下子打开了思路。
在这里，他碰到了类似的病例。医学上把他们称之为「艾滋病精英控制者」，也就是说，有一群人生来就有控制 HIV 病毒的「超能力」。
他们人数极少，不到 HIV 感染者的 0.5%。与生俱来就能依靠自己的免疫系统初步控制病毒。当然也跟药物治疗结果一样，初步控制后的病毒还是呆在病毒储存库中，虽然量很低很难检测到，但是隐患犹存。
来自麻省理工学院的 Xu Yu 团队一直关注着他们，希望从这些「精英控制者」身上找到艾滋病的治疗密码。他们采用了更先进的技术逐一分析精英控制者的细胞，通过病毒基因测序，把常规检测不好找到的微量病毒也找出来，看看是不是有所不同。
讲到这里你应该就明白了，姑娘显然也是「精英控制者」的一员，天生拥有初步抵抗 HIV 病毒的能力。从 2017 年起，姑娘正式加入了这个联盟，和近百位「精英控制者」一起，不断接受细胞级别的检测。
这一检查可了不得，姑娘居然是近百位控制者里的特殊案例。
在详细的细胞级别检测中，其他的精英控制者都能在数以十亿计的细胞中找到不少活着的病毒或者是病毒几乎完整的尸体。但是姑娘初步检查了几亿细胞都没有完整活着的病毒，连相对完整的尸体都没有，只有几个病毒「尸块」。
类比一下，她的地位相当于精英中的精英，复联里的灭霸！没打响指，HIV 病毒就活不下去了。
检测中只发现了只一段还算相对完整的病毒序列。也正是这段序列告诉我们，姑娘身体内确实发生过 HIV 病毒的复制。她是真的彻彻底底感染之后，然后自己又干掉了病毒。
一边是越检测越高兴，姑娘很可能会成为艾滋病研究的新希望。另一边，毕竟检测都说姑娘没啥事儿了，她的生活也迈入了正轨，认识了新伴侣。
然后，她怀孕了。为了万无一失，她第一次在孕期接受了 6 个月的抗病毒药物治疗（对于普通的 HIV 感染者来说，这种方式是阻断母婴传播的绝佳手段）。
2020 年 3 月，姑娘成功生下了一个宝宝。
赶在因为新冠疫情阿根廷全境封锁的前夕，研究人员连夜检测了她的胎盘，结果同样让人兴奋。胎盘完全没有一点儿 HIV 病毒痕迹，也就是说，这个新生儿完完全全是个健康宝宝。
生育之后，细胞级别的检测还在继续，到今天为止，已经检测了姑娘身体内 11.88 亿个细胞，还是没有任何活跃病毒迹象。
也许，艾滋病真的已经「自愈」了。
三、也许我们将迎来艾滋病治愈的希望
姑娘算是第 4 个治愈艾滋病的患者。
在此之前，医学界发现了柏林病人和伦敦病人。他们的情况都非常特殊，在患有艾滋病的同时，患上了血液系统肿瘤，进行造血干细胞移植之后治愈了艾滋病。治愈可能既跟造血干细胞移植有关，也跟血液肿瘤有关。他们之后科学家做了很多复现的努力，都没能取得成功。
「艾滋病精英控制者」则是另一条路径，更多靠的是患者自身的「天赋」。2020 年，Xu Yu 团队就曾公布了一例治愈的旧金山病人，同样出自这次大规模的精英控制者筛查。只是旧金山病人的既往治疗信息还待更具体公开。
我们还不能说，发现病例就等于拿到了艾滋病治疗的钥匙。但这的的确确给治疗提供了良好的思路。
这些人体内可能存在特定的杀伤性 T 细胞应答机制。如果扩大寻找范围，检查更多精英控制者，还有可能找到其他治愈者。分析这些患者，发现背后的免疫机制，让更多艾滋病患者的免疫系统复现这种应答方式。
那么也许真的能有一天，我们真的能把艾滋病治好。
这个姑娘被研究者用地名称呼叫做「埃斯佩拉萨（西班牙语：希望）」。根据她的意愿，隐私被保护得很好。
她依然在继续参加医学研究，经历被记录进了顶级医学期刊，成为世界瞩目的焦点。
宝宝很健康，现在的伴侣也很健康，她完全摆脱了那场天降之灾的阴影，进入人生的新阶段，正在期待自己的第二个宝宝降生。
不过这一切，她的前男友都不知道。
2017 年，他因艾滋病去世了。
ibidi µ-Patterns 上的细胞粘附：实验参数和优化
本应用说明讨论了对于细胞粘附到 ibidi µ-Patterns 的重要实验参数。此外，它还解释了如何优化细胞粘附和模式覆盖。
关键词
· µ-Patterning、粘附、结合基序、单细胞模式、多细胞微模式、细胞培养、粘附细胞
细胞类型
ibidi µ-Patterning 的成功实验仅限于贴壁细胞类型——悬浮细胞不能附着在图案表面。此外，对 µ-Pattern 表面的粘附高度依赖于细胞类型，因为并非所有细胞类型都与所有结合基序结合。因此，在开始实验之前，有必要测试所选细胞类型是否能够粘附在图案表面上。
结合基序
ibidi µ-Patterning 技术为细胞粘附提供共价结合的结合基序。这些结合基序的表面密度可能不同于经典的蛋白质涂层。因此，结合基序可能导致细胞形态或粘附行为的改变。测试您的细胞是否与结合基序兼容的最佳方法是将它们接种在具有大粘合面积的图案点上（例如，多细胞图案）。验证单元格兼容性后，您可以切换到更小的模式，例如单单元格模式。
几何图案
由于结合基序的数量，图案几何形状会影响细胞的粘附行为。例如，较小的形状呈现较少的结合基序，与较大的形状相比，这可能会降低细胞粘附。特别是对于单细胞实验，需要在图案上实现单细胞占有率，图案尺寸非常重要，因为太小的图案阻碍了适当的细胞粘附和扩散，而太大的图案会导致多个细胞粘附在一个单点。此外，当所用细胞类型的间距太小时，粘附斑块之间的间距会影响理想的细胞接种浓度和细胞从一个点到另一个点的桥接。
细胞接种浓度
接种浓度是优化粘附过程的另一个关键参数。较低的浓度会导致图案上的细胞较少，或者只有稀疏占据的斑点，但结块较少。较高的细胞浓度可以提高细胞覆盖率，但要承担 a) 结块和 b) 在单细胞粘附位点上出现多个细胞的风险。如果细胞浓度太高并且细胞在附着到粘附点之前开始聚集，这些漂浮的聚集体可能会从模式中分离粘附细胞并阻止进一步的细胞粘附。
细胞悬液质量
细胞悬液的均匀性高度影响实验输出。没有任何细胞聚集体的单细胞悬浮液非常适合单细胞检测。接种细胞簇或球体悬浮液是 3D多细胞检测的一种选择。
培养时间
接种细胞后的孵育时间会影响粘附过程。与其他表面相比，细胞附着在图案上所需的时间可能不同。在粘合过程中移动 µ-Patterned 载玻片时要特别小心。未连接或仅松散连接的细胞可能会开始结块。
机械应力和洗涤
部分附着的细胞可能会被机械力冲走。利用这种效果有助于去除细胞或碎片。根据洗涤步骤的强度（剪切应力），可能会从表面洗掉更多或更少的细胞。
细胞适合度
细胞的活力和适应性是适当细胞粘附的重要因素。因此，请确保优化细胞制备过程，以最大限度地减少细胞压力。优化和标准化影响细胞健康的因素，例如化学分离、温度、机械应力、悬浮时间、培养基成分和其他细胞培养参数。
优化 µ-Pattern 上的细胞粘附
初步测试：细胞类型是否与 µ-Pattern 兼容？
如果您不知道您的细胞类型是否与 µ-Patterning 的结合基序兼容，我们建议首先在多细胞 µ-Pattern 上运行初始细胞粘附测试。在较大图案上测试粘附减少了对结合基序本身的初始兼容性测试，同时排除了单细胞和图案几何效应。
· 按照说明中的协议使用 2-3 种不同的细胞接种浓度，并通过将它们孵育至少 4 小时直至过夜，让细胞不受干扰地粘附。
· 在洗掉未附着的细胞之前, 用相差显微镜控制细胞附着。拍摄细胞图像总是有助于随后优化过程。
· 洗涤后至少 2 小时拍摄额外的图像，让细胞有时间从洗涤时经历的剪切应力中恢复。
请注意：在此阶段，不需要最佳模式覆盖。任何细胞都坚持该模式是很重要的。如果是这种情况，您可以继续优化所需模式的播种参数。如果您在孵育过夜后仍未在图案上看到任何细胞附着，则您的细胞类型可能与所使用的结合基序不兼容。
优化附着在 µ-Pattern 上的细胞的播种参数
如果您知道细胞与 µ-Pattern 的结合基序结合，则可以开始优化所需模式上的细胞接种参数。请考虑每个模式都需要针对您的特定细胞类型进行优化，因为模式大小和模式之间的距离在很大程度上影响播种参数。确保细胞至关重要，并且您有单细胞悬液。
第一次优化运行
· 按照说明在载玻片上接种至少三种不同浓度的细胞。
· 让细胞在洗涤前无干扰地粘附至少 4 小时。
· 在洗涤前和洗涤后至少 2 小时拍摄细胞图像。
可能的结果和故障排除
– 洗涤后，细胞很好地固定在图案上，图案覆盖度很好。
您已经为您的实验找到了合适的播种参数。您可以使用相同的条件开始您的实验。
– 洗涤前，只有少数细胞漂浮和聚集。洗涤后，图案上的细胞很少，图案覆盖率差。
细胞密度可能太低。在洗去未附着的细胞之前，尝试更高的接种浓度并考虑更长的孵育时间。
– 在洗涤之前，有很多漂浮的、聚集的细胞。洗涤后，图案上的细胞很少，图案覆盖率差。
细胞密度可能太高。尝试降低初始接种浓度，因为过高的细胞密度通常会导致细胞聚集，阻碍细胞与模式结合。此外，在播种后 2 小时和 3 小时检查细胞，看看更短的孵化时间是否会导致更少的聚集，从而更好地覆盖模式。
– 洗涤后，图案上会出现不需要的细胞聚集。
这表明初始接种浓度太高/或洗涤前孵育时间太长。尝试较低的接种浓度，并在 2 小时和 3 小时后检查细胞，看看较短的孵育时间是否足以使细胞粘附良好。
– 当使用小的单细胞斑点或细线时，图案上没有细胞粘附或细胞呈圆形且不会扩散。
如果您从之前的实验中知道细胞可以与所使用的图案结合基序结合，则图案尺寸对于您的细胞类型来说可能太小，并且细胞没有足够的空间来正确传播和粘附。因此，为您的实验使用更大的图案尺寸。
第二次优化运行
· 如上所述，根据第一次优化运行的结果使用优化的细胞培养参数。
将您的结果与第一次优化运行进行比较，如有必要，进入另一轮优化。
示例图像
图1，L929 细胞不同接种浓度对单个细胞模式的影响。(A) 将细胞以 1*10 5cells/ml加入µ-Slide VI 0.4，(B) 3*10 5 cells/ml、(C) ) 5.25*105 cells/ml。24 小时后，洗去未附着的细胞，并在洗涤后 2 小时拍摄图像。在低接种密度下，许多点没有被任何细胞覆盖。然而，在太高的接种浓度下，细胞开始在图案上聚集。
图 2：不同图案孔大小对 Rat1 细胞在单个细胞图案上的传播行为的影响。将细胞接种到 µ-Slide VI0.4中，µ-Pattern 为 (A) 20 µm 正方形，距离为 110 µm 或 (B) 30 µm 正方形，距离为 110 µm，浓度为 9*105 cells/ml。24 小时后，洗去未附着的细胞，并在洗涤后 2 小时拍摄图像。对于 Rat1 细胞，20 µm 正方形对于良好的细胞扩散来说太小了，而 30 µm 正方形为细胞提供了足够的区域以在图案上展平。
图 3：不同图案几何形状对 NIH3T3 细胞在单个细胞图案上的扩散行为的影响。将细胞接种到 µ-Slide VI0.4中，µ-Pattern 为 (A) 20 µm 正方形，距离为 110 µm，或 (B) 30 µm 正方形，距离为 110 µm，浓度为 3* 10 5 cells/ml。24 小时后，洗去未附着的细胞，并在洗涤后 2 小时拍摄图像。对于 NIH3T3 细胞，20 µm 正方形对于良好的细胞扩散来说太小了，而 30 µm 正方形为细胞提供了足够的区域以使其在图案上变平。然而，由于图案边缘之间的距离小了 10 µm，细胞能够从一个点连接到另一个点。对于该细胞系，需要更大的图案之间的距离。
本应用说明讨论了对于细胞粘附到 ibidi µ-Patterns 的重要实验参数。此外，它还解释了如何优化细胞粘附和模式覆盖。
关键词
· µ-Patterning、粘附、结合基序、单细胞模式、多细胞微模式、细胞培养、粘附细胞
细胞类型
ibidi µ-Patterning 的成功实验仅限于贴壁细胞类型——悬浮细胞不能附着在图案表面。此外，对 µ-Pattern 表面的粘附高度依赖于细胞类型，因为并非所有细胞类型都与所有结合基序结合。因此，在开始实验之前，有必要测试所选细胞类型是否能够粘附在图案表面上。
结合基序
ibidi µ-Patterning 技术为细胞粘附提供共价结合的结合基序。这些结合基序的表面密度可能不同于经典的蛋白质涂层。因此，结合基序可能导致细胞形态或粘附行为的改变。测试您的细胞是否与结合基序兼容的最佳方法是将它们接种在具有大粘合面积的图案点上（例如，多细胞图案）。验证单元格兼容性后，您可以切换到更小的模式，例如单单元格模式。
几何图案
由于结合基序的数量，图案几何形状会影响细胞的粘附行为。例如，较小的形状呈现较少的结合基序，与较大的形状相比，这可能会降低细胞粘附。特别是对于单细胞实验，需要在图案上实现单细胞占有率，图案尺寸非常重要，因为太小的图案阻碍了适当的细胞粘附和扩散，而太大的图案会导致多个细胞粘附在一个单点。此外，当所用细胞类型的间距太小时，粘附斑块之间的间距会影响理想的细胞接种浓度和细胞从一个点到另一个点的桥接。
细胞接种浓度
接种浓度是优化粘附过程的另一个关键参数。较低的浓度会导致图案上的细胞较少，或者只有稀疏占据的斑点，但结块较少。较高的细胞浓度可以提高细胞覆盖率，但要承担 a) 结块和 b) 在单细胞粘附位点上出现多个细胞的风险。如果细胞浓度太高并且细胞在附着到粘附点之前开始聚集，这些漂浮的聚集体可能会从模式中分离粘附细胞并阻止进一步的细胞粘附。
细胞悬液质量
细胞悬液的均匀性高度影响实验输出。没有任何细胞聚集体的单细胞悬浮液非常适合单细胞检测。接种细胞簇或球体悬浮液是 3D多细胞检测的一种选择。
培养时间
接种细胞后的孵育时间会影响粘附过程。与其他表面相比，细胞附着在图案上所需的时间可能不同。在粘合过程中移动 µ-Patterned 载玻片时要特别小心。未连接或仅松散连接的细胞可能会开始结块。
机械应力和洗涤
部分附着的细胞可能会被机械力冲走。利用这种效果有助于去除细胞或碎片。根据洗涤步骤的强度（剪切应力），可能会从表面洗掉更多或更少的细胞。
细胞适合度
细胞的活力和适应性是适当细胞粘附的重要因素。因此，请确保优化细胞制备过程，以最大限度地减少细胞压力。优化和标准化影响细胞健康的因素，例如化学分离、温度、机械应力、悬浮时间、培养基成分和其他细胞培养参数。
优化 µ-Pattern 上的细胞粘附
初步测试：细胞类型是否与 µ-Pattern 兼容？
如果您不知道您的细胞类型是否与 µ-Patterning 的结合基序兼容，我们建议首先在多细胞 µ-Pattern 上运行初始细胞粘附测试。在较大图案上测试粘附减少了对结合基序本身的初始兼容性测试，同时排除了单细胞和图案几何效应。
· 按照说明中的协议使用 2-3 种不同的细胞接种浓度，并通过将它们孵育至少 4 小时直至过夜，让细胞不受干扰地粘附。
· 在洗掉未附着的细胞之前, 用相差显微镜控制细胞附着。拍摄细胞图像总是有助于随后优化过程。
· 洗涤后至少 2 小时拍摄额外的图像，让细胞有时间从洗涤时经历的剪切应力中恢复。
请注意：在此阶段，不需要最佳模式覆盖。任何细胞都坚持该模式是很重要的。如果是这种情况，您可以继续优化所需模式的播种参数。如果您在孵育过夜后仍未在图案上看到任何细胞附着，则您的细胞类型可能与所使用的结合基序不兼容。
优化附着在 µ-Pattern 上的细胞的播种参数
如果您知道细胞与 µ-Pattern 的结合基序结合，则可以开始优化所需模式上的细胞接种参数。请考虑每个模式都需要针对您的特定细胞类型进行优化，因为模式大小和模式之间的距离在很大程度上影响播种参数。确保细胞至关重要，并且您有单细胞悬液。
第一次优化运行
· 按照说明在载玻片上接种至少三种不同浓度的细胞。
· 让细胞在洗涤前无干扰地粘附至少 4 小时。
· 在洗涤前和洗涤后至少 2 小时拍摄细胞图像。
可能的结果和故障排除
– 洗涤后，细胞很好地固定在图案上，图案覆盖度很好。
您已经为您的实验找到了合适的播种参数。您可以使用相同的条件开始您的实验。
– 洗涤前，只有少数细胞漂浮和聚集。洗涤后，图案上的细胞很少，图案覆盖率差。
细胞密度可能太低。在洗去未附着的细胞之前，尝试更高的接种浓度并考虑更长的孵育时间。
– 在洗涤之前，有很多漂浮的、聚集的细胞。洗涤后，图案上的细胞很少，图案覆盖率差。
细胞密度可能太高。尝试降低初始接种浓度，因为过高的细胞密度通常会导致细胞聚集，阻碍细胞与模式结合。此外，在播种后 2 小时和 3 小时检查细胞，看看更短的孵化时间是否会导致更少的聚集，从而更好地覆盖模式。
– 洗涤后，图案上会出现不需要的细胞聚集。
这表明初始接种浓度太高/或洗涤前孵育时间太长。尝试较低的接种浓度，并在 2 小时和 3 小时后检查细胞，看看较短的孵育时间是否足以使细胞粘附良好。
– 当使用小的单细胞斑点或细线时，图案上没有细胞粘附或细胞呈圆形且不会扩散。
如果您从之前的实验中知道细胞可以与所使用的图案结合基序结合，则图案尺寸对于您的细胞类型来说可能太小，并且细胞没有足够的空间来正确传播和粘附。因此，为您的实验使用更大的图案尺寸。
第二次优化运行
· 如上所述，根据第一次优化运行的结果使用优化的细胞培养参数。
将您的结果与第一次优化运行进行比较，如有必要，进入另一轮优化。
示例图像
图1，L929 细胞不同接种浓度对单个细胞模式的影响。(A) 将细胞以 1*10 5cells/ml加入µ-Slide VI 0.4，(B) 3*10 5 cells/ml、(C) ) 5.25*105 cells/ml。24 小时后，洗去未附着的细胞，并在洗涤后 2 小时拍摄图像。在低接种密度下，许多点没有被任何细胞覆盖。然而，在太高的接种浓度下，细胞开始在图案上聚集。
图 2：不同图案孔大小对 Rat1 细胞在单个细胞图案上的传播行为的影响。将细胞接种到 µ-Slide VI0.4中，µ-Pattern 为 (A) 20 µm 正方形，距离为 110 µm 或 (B) 30 µm 正方形，距离为 110 µm，浓度为 9*105 cells/ml。24 小时后，洗去未附着的细胞，并在洗涤后 2 小时拍摄图像。对于 Rat1 细胞，20 µm 正方形对于良好的细胞扩散来说太小了，而 30 µm 正方形为细胞提供了足够的区域以在图案上展平。
图 3：不同图案几何形状对 NIH3T3 细胞在单个细胞图案上的扩散行为的影响。将细胞接种到 µ-Slide VI0.4中，µ-Pattern 为 (A) 20 µm 正方形，距离为 110 µm，或 (B) 30 µm 正方形，距离为 110 µm，浓度为 3* 10 5 cells/ml。24 小时后，洗去未附着的细胞，并在洗涤后 2 小时拍摄图像。对于 NIH3T3 细胞，20 µm 正方形对于良好的细胞扩散来说太小了，而 30 µm 正方形为细胞提供了足够的区域以使其在图案上变平。然而，由于图案边缘之间的距离小了 10 µm，细胞能够从一个点连接到另一个点。对于该细胞系，需要更大的图案之间的距离。
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