《步踏神罡，上达天听！道教流传最广的“八大神咒”，可逢凶化吉！》
《皇经集注》卷五《神咒品第一章》云：以经中秘法语，能度人箓仙，制星，制魔，制水，镇五方，济法界，故曰神咒。从此可看出咒是神明宣经说法的秘言法旨，是具有很多神通力量的一种语言。
道教神咒主要用于祈禳、治病等场合。并要求念诵时，身心洁净，虔诚、存心诵之而往往灵验。修炼之人诵之，有助于入静炼养。
我们今天常看到的道教咒语是出自《早晚功课经》的八大神咒，通过网络已经广被人知。八大神咒是道教诸多门派广泛普遍遵行的几种常用咒语，也是道士日常功课中用来涤除心中罪孽，卫护心神，请召神明护持，开经演道所用。是学道修道入门必修必会之咒。
八大神咒，应用极广。举凡诵经、禳解、临坛、书符、行法等都需要念这八个咒语，它也是修炼符咒法术的必需程序。
一、净心神咒
太上台星，应变无停。
驱邪缚魅，保命护身。
智慧明净，心神安宁。
三魂永久，魄无丧倾。
急急如律令。
净心神咒为八神咒之首 ，顾名思义为修道之人早晚功课及学炼符法时净化身心，排除杂念，安定心神时所用之咒。
此咒能使凡心入于冥寂，返观道心，入于清静之中。并有保魂护魄的作用。
二、净口神咒
丹朱口神，吐秽除氛。
舌神正伦，通命养神。
罗千齿神，却邪卫真。
喉神虎贲，炁神引津。
心神丹元，令我通真。
思神炼液，道炁常存。
急急如律令。
净口神咒含有两层真意，一为：我人生于世俗，难免谤经毁道，妄言他人之过。
更有世人不信鬼神，指天骂地，绮语两舌，咒诅谀曲。此皆为口业。
另居于尘俗，三荤五腥难免避讳。
口气腥檀膻臭。诵经论法，污秽三宝。故应常诵净口神咒消除口业，祈请正神，涤除口中秽气。
清静口舌后方能诵经念咒，通真达道。
三、净身神咒
灵宝天尊，安慰身形。
弟子魂魄，五脏玄冥。
青龙白虎，队仗纷纭；
朱雀玄武，侍卫我真。
急急如律令。
净身神咒可令身体内的四正之神归于正位，消除身业，拥护身形，保卫道体，所谓身业即杀盗透淫等罪。
使修道之人身体清静，能以清静之身感召神灵。
四、安土地神咒
元始安镇，普告万灵。
岳渎真官，土地祗灵。
左社右稷，不得妄惊。
回向正道，内外澄清。
各安方位，备守坛（家）庭。
太上有命，搜捕邪精。
护法神王，保卫诵经。
皈依大道，元亨利贞。
安土地神咒为结坛行法召遣土地山神，以使之代为凡夫奏告上天，保卫正道时所用。
五、净天地神咒
天地自然，秽炁分散。
洞中玄虚，晃朗太元。
八方威神，使我自然。
灵宝符命，普告九天；
乾罗答那，洞罡太玄；
斩妖缚邪，度人（杀鬼）万千。
中山神咒，元始玉文，
持诵一遍，却病延年；
按行五岳，八海知闻；
魔王束首，侍卫我轩；
凶秽消散，道炁常存。
急急如律令。
净天地神咒可以制魔召灵，役使群灵，安镇五岳，保天地长存，扫荡厌秽，正气充沛，使邪气消灭，祛病长生。
天地之间，污秽太多，均由人为，所以需要此咒以清净之。
六、金光神咒
天地玄宗，万炁本根。
广修亿劫，证吾神通。
三界内外，惟道独尊。
体有金光，覆映吾身。
视之不见，听之不闻。
包罗天地，养育群生。
受持万遍，身有光明。
三界侍卫，五帝司迎。
万神朝礼，役使雷霆，
鬼妖丧胆，精怪忘形。
内有霹雳，雷神隐名。
洞慧交彻，五炁腾腾。
金光速现，覆护真人。
急急如律令。
金光神咒可以帮助修炼、驱除魔障、护身辟邪，还可以加减咒句修炼法宝等等，作用巨大，而且是雷霆召炼的必用。
七、祝香咒
道由心学，心假香传。
香爇玉炉，心存帝前。
真灵下盼，仙旆临轩。
令臣关告，迳达九天。
祝香神咒作用于加强心灵信仰，得到心灵辟邪的能力。
八、玄蕴咒
云篆太虚，浩劫之初。
乍遐乍迩，或沉或浮。
五方徘徊，一丈之余。
天真皇人，按笔乃书。
以演洞章，次书灵符。
元始下降，真文诞敷。
昭昭其有，冥冥其无。
沉疴能自痊，尘劳溺可扶，
幽冥将有赖。由是升仙都。
玄蕴咒，与诸路仙真神将结缘，日后法成之时，可得其相助。
《皇经集注》卷五《神咒品第一章》云：以经中秘法语，能度人箓仙，制星，制魔，制水，镇五方，济法界，故曰神咒。从此可看出咒是神明宣经说法的秘言法旨，是具有很多神通力量的一种语言。
道教神咒主要用于祈禳、治病等场合。并要求念诵时，身心洁净，虔诚、存心诵之而往往灵验。修炼之人诵之，有助于入静炼养。
我们今天常看到的道教咒语是出自《早晚功课经》的八大神咒，通过网络已经广被人知。八大神咒是道教诸多门派广泛普遍遵行的几种常用咒语，也是道士日常功课中用来涤除心中罪孽，卫护心神，请召神明护持，开经演道所用。是学道修道入门必修必会之咒。
八大神咒，应用极广。举凡诵经、禳解、临坛、书符、行法等都需要念这八个咒语，它也是修炼符咒法术的必需程序。
一、净心神咒
太上台星，应变无停。
驱邪缚魅，保命护身。
智慧明净，心神安宁。
三魂永久，魄无丧倾。
急急如律令。
净心神咒为八神咒之首 ，顾名思义为修道之人早晚功课及学炼符法时净化身心，排除杂念，安定心神时所用之咒。
此咒能使凡心入于冥寂，返观道心，入于清静之中。并有保魂护魄的作用。
二、净口神咒
丹朱口神，吐秽除氛。
舌神正伦，通命养神。
罗千齿神，却邪卫真。
喉神虎贲，炁神引津。
心神丹元，令我通真。
思神炼液，道炁常存。
急急如律令。
净口神咒含有两层真意，一为：我人生于世俗，难免谤经毁道，妄言他人之过。
更有世人不信鬼神，指天骂地，绮语两舌，咒诅谀曲。此皆为口业。
另居于尘俗，三荤五腥难免避讳。
口气腥檀膻臭。诵经论法，污秽三宝。故应常诵净口神咒消除口业，祈请正神，涤除口中秽气。
清静口舌后方能诵经念咒，通真达道。
三、净身神咒
灵宝天尊，安慰身形。
弟子魂魄，五脏玄冥。
青龙白虎，队仗纷纭；
朱雀玄武，侍卫我真。
急急如律令。
净身神咒可令身体内的四正之神归于正位，消除身业，拥护身形，保卫道体，所谓身业即杀盗透淫等罪。
使修道之人身体清静，能以清静之身感召神灵。
四、安土地神咒
元始安镇，普告万灵。
岳渎真官，土地祗灵。
左社右稷，不得妄惊。
回向正道，内外澄清。
各安方位，备守坛（家）庭。
太上有命，搜捕邪精。
护法神王，保卫诵经。
皈依大道，元亨利贞。
安土地神咒为结坛行法召遣土地山神，以使之代为凡夫奏告上天，保卫正道时所用。
五、净天地神咒
天地自然，秽炁分散。
洞中玄虚，晃朗太元。
八方威神，使我自然。
灵宝符命，普告九天；
乾罗答那，洞罡太玄；
斩妖缚邪，度人（杀鬼）万千。
中山神咒，元始玉文，
持诵一遍，却病延年；
按行五岳，八海知闻；
魔王束首，侍卫我轩；
凶秽消散，道炁常存。
急急如律令。
净天地神咒可以制魔召灵，役使群灵，安镇五岳，保天地长存，扫荡厌秽，正气充沛，使邪气消灭，祛病长生。
天地之间，污秽太多，均由人为，所以需要此咒以清净之。
六、金光神咒
天地玄宗，万炁本根。
广修亿劫，证吾神通。
三界内外，惟道独尊。
体有金光，覆映吾身。
视之不见，听之不闻。
包罗天地，养育群生。
受持万遍，身有光明。
三界侍卫，五帝司迎。
万神朝礼，役使雷霆，
鬼妖丧胆，精怪忘形。
内有霹雳，雷神隐名。
洞慧交彻，五炁腾腾。
金光速现，覆护真人。
急急如律令。
金光神咒可以帮助修炼、驱除魔障、护身辟邪，还可以加减咒句修炼法宝等等，作用巨大，而且是雷霆召炼的必用。
七、祝香咒
道由心学，心假香传。
香爇玉炉，心存帝前。
真灵下盼，仙旆临轩。
令臣关告，迳达九天。
祝香神咒作用于加强心灵信仰，得到心灵辟邪的能力。
八、玄蕴咒
云篆太虚，浩劫之初。
乍遐乍迩，或沉或浮。
五方徘徊，一丈之余。
天真皇人，按笔乃书。
以演洞章，次书灵符。
元始下降，真文诞敷。
昭昭其有，冥冥其无。
沉疴能自痊，尘劳溺可扶，
幽冥将有赖。由是升仙都。
玄蕴咒，与诸路仙真神将结缘，日后法成之时，可得其相助。
將一切所緣轉為道用■《解脫莊嚴寶論》口傳，信心與依止善知識：今天繼續《解脫莊嚴寶論》之口傳：接下來唸誦部分為信心部分：這裡講到遇快樂不能移、兇惡不能移、恐懼不能移及愚痴不能移等，遇到這四種違緣時，信心要堅定不移。<<聖十法經>>云：「人若不具信、白法不成就，如種被火燒、不能生苗芽」。<<華嚴經>>云：「信心微小諸眾生，難知菩提微妙法。」因此生起信心是非常重要的。<<大莊嚴經>>云：佛說「阿難！應生信心！此乃如來之祈請！」因此，所謂信心為何？信心分為三類：即勝解信、欲樂信及清淨信。其中◆勝解信：是依照對境業果與苦諦、集諦而生起，彼亦即誠信善業之果引生欲界的安樂，誠信不善業之果引生欲界的痛苦，誠信不動業引升上二界的安樂。誠信所謂集諦，及業與煩惱造作故，所謂苦諦，及感得有漏的五蘊。◆欲樂信：是指見到比無上菩提的殊勝後，為獲得彼而恭敬學道。◆清淨信：是依於對境三寶而生起，即於能宣講道之佛寶、成為道之法寶和成為修道助伴之僧寶以清淨信恭敬信受。<<具捨論>>云：信心者何云？即於業果聖諦和三寶之現前勝解信、欲樂信和清淨信。<<寶縵論>>亦云：誰不由欲嗔，怖痴而越法，彼謂具信者，定聖妙法器。其中◆不以欲望而越法：即不因貪欲而捨棄正法，譬如他人說，賜與你食物、珍寶、美女和國政等大獎賞而捨法，亦不捨棄。◆不以嗔恚而越法：即不因嗔恚方面捨棄正法，譬如他人以前曾對你做過極大損害，仍然要有任一極大損害，亦不捨棄正法。◆不以怖畏而越法：即不因恐怖方面而捨法譬如有人說，「你如果不捨棄正法，就派三百名勇士，每天割你五兩身肉」，亦不捨棄正法。◆不以愚痴而越法：即不因無知方面而捨法，譬如有人說，業不真實，果不真實，三寶不真實，你從事於法何用？捨法吧！亦不捨棄正法。具有如是四種彼即是具信者，是堪為修持決定勝的妙法器。如是若有彼等信心則功德利益無量，即：乃勝士夫之發心、斷除諸無瑕、諸根明利、戒律無缺、消除煩惱、遠離魔境，獲解脫道，廣集善業，見眾多佛、蒙佛加持、出生彼等等不可思議的功德。此亦如<<大方廣總持寶光明經>>云：信于佛佛法，能信佛子行，信無上菩提，諸大士發心。又若具有信心，諸佛世尊也會蒞臨其近前宣說正法。<<佛說大乘菩薩正法經>>云：如是住信菩薩，諸佛世尊知是諸佛法之法器，即詣彼前，如實宣說菩薩之道。如是所謂人身寶，身體具有暇滿二者、心具有三種信心，這即是修證無上菩提所依之樸特伽羅。法王噶瑪巴第十八屆噶舉冬季辯經大法會開示第八世噶瑪巴米覺多傑教言（第八天）課程：《無死甘露妙樹》又稱《百段引導文》教授：尊勝的第十七世大寶法王 噶瑪巴地點：德噶寺大殿時間：2014年12月10日藏譯中：倫多祖古大寶法王官網
法王噶瑪巴｜《吉祥如意每一天》P672005年，宗門實修「四共加行」 當下一念假如我的念頭是清淨的、尊敬的、慈愛他人的話，即會成為善業。假如動機是我慢的、嫉妒的、對他人帶著惡念的話，即會成為惡業。因此，所謂的業，並非只是前世所造作的，而是每一個當下都在造作。
噶瑪巴尊者《寶積經》中云: 『一切眾生，若有身具五逆十惡重罪之者，萬劫千生不通懺悔，應須頂禮三十五佛，至心懺悔，一切罪障，皆得除滅。』法王 殷殷提醒：三皈依、三十五佛懺悔文這是各種懺悔文中最重要的，一個修行人每天應該念一遍。〈三十五佛懺悔文〉，這對造作重大罪業的人尤其需要。要知道無始劫以我們有無量投生，所以就有無量罪業，現在可能很難全部記起來，但要全部懺悔，包括在不知道的情況所犯的罪業。一個人在背負很多罪業的狀況下很難利益別人，所以一定要懺悔，而且自他一切罪都要懺悔。《第30屆噶舉大祈願法會．開幕日記要》當修行者繫於眾生的心念通過無數次依止修持，最終達到很高成就時，就會格外關愛眾生，如同珍惜自己一般去愛戴其他眾生，這時就會覺得自己受苦也無妨，自己的快樂幸福及一切，都可以奉獻給眾生。第十七世大寶法王 噶瑪巴 鄔金欽列多傑慈悲喜捨每一天：讓愛無限延伸的365項修練
法王噶瑪巴｜《吉祥如意每一天》P672005年，宗門實修「四共加行」 當下一念假如我的念頭是清淨的、尊敬的、慈愛他人的話，即會成為善業。假如動機是我慢的、嫉妒的、對他人帶著惡念的話，即會成為惡業。因此，所謂的業，並非只是前世所造作的，而是每一個當下都在造作。
噶瑪巴尊者《寶積經》中云: 『一切眾生，若有身具五逆十惡重罪之者，萬劫千生不通懺悔，應須頂禮三十五佛，至心懺悔，一切罪障，皆得除滅。』法王 殷殷提醒：三皈依、三十五佛懺悔文這是各種懺悔文中最重要的，一個修行人每天應該念一遍。〈三十五佛懺悔文〉，這對造作重大罪業的人尤其需要。要知道無始劫以我們有無量投生，所以就有無量罪業，現在可能很難全部記起來，但要全部懺悔，包括在不知道的情況所犯的罪業。一個人在背負很多罪業的狀況下很難利益別人，所以一定要懺悔，而且自他一切罪都要懺悔。《第30屆噶舉大祈願法會．開幕日記要》當修行者繫於眾生的心念通過無數次依止修持，最終達到很高成就時，就會格外關愛眾生，如同珍惜自己一般去愛戴其他眾生，這時就會覺得自己受苦也無妨，自己的快樂幸福及一切，都可以奉獻給眾生。第十七世大寶法王 噶瑪巴 鄔金欽列多傑慈悲喜捨每一天：讓愛無限延伸的365項修練
【更高效、广适、精准基因编辑2.0升级版赋予更强个性化修改能力】中国科学报:近日，中国科学院遗传与发育生物学研究所（以下简称遗传发育所）高彩霞研究组与合作者，在植物中成功建立了一种更高效、广适的新型基因组引导编辑系统——增强型植物引导编辑器（ePPE），有助进一步提高基因组编辑技术在内源基因上进行精准编辑的效率。研究人员还利用该系统创制了抗除草剂的水稻新材料。相关结果3月24日在线发表于《自然—生物技术》。
“这项工作论证充分且十分有趣。”一位审稿人写道，“引导编辑提供了对基因组进行定制化更改的能力，克服了碱基编辑器有限的替代能力。作者描述的引导编辑器可在植物基因组上将引导编辑效率提高数倍。”
“2.0时代”的引导编辑
在农业领域，基因组编辑技术可以更方便、快捷、精准地进行作物育种和改良。通过基因组编辑可以不添加任何外源性的基因，实现对基因组自身序列的修改，大大节省了时间和工作量。
事实上，基因组编辑技术从2012年诞生至今，经过10年的发展已经不仅仅是“一把剪刀”的概念。论文通讯作者、遗传发育所研究员高彩霞在接受《中国科学报》采访时介绍，进化至“2.0时代”的碱基编辑和引导编辑还可以是一块“橡皮”或一支“铅笔”。
“如果一个序列有点多，你可以把它剪掉；如果组成DNA的四个字母ATCG有一个错了，你可以像用一个‘橡皮擦’把它擦掉，然后用‘铅笔’写入正确字母，而‘铅笔’、‘橡皮擦’是不留在细胞里的。”她比喻说。
更具体地说，引导编辑系统（PE）是一种能够在基因组的靶位点处实现任意碱基替换和小片段精准删除、插入的新型基因组编辑工具，也是基因组编辑领域的重大变革。
2020年，高彩霞团队率先在水稻和小麦中成功建立并优化了适用于植物的引导编辑器（PPE），开发了植物引导编辑向导RNA（pegRNA）设计网站——PlantPegDesigner，极大提高了引导编辑效率并简化了植物pegRNA的设计流程。他们还通过全基因组重测序发现PPE系统在全基因组水平上具有很高的特异性。这些研究为引导编辑系统在植物领域的应用奠定了良好的基础。
尽管如此，引导编辑系统目前在植物中的编辑效率仍不够高，且有很大的靶点依赖性。“也就是说在一些内源靶位点上，现有的引导编辑系统效率仍然很低，尤其是针对一些较长片段的删除、插入这种复杂的编辑类型。”论文第一作者、高彩霞课题组博士生刘怡静向《中国科学报》解释。
这些短板严重限制了引导编辑在植物中的广泛应用。因此，如何优化引导编辑系统突破现有的限制，提升引导编辑技术的高效性、广适性是一个研究重点。
寻找更高效“突破点”
万事开头难。如何去优化引导编辑系统，实现更高效、广适的编辑呢？这是合作团队一直思考的问题。为此，他们先后构思尝试了多种不同策略，最终通过对蛋白的理性设计获得了能够稳定提高效率的ePPE的版本。
不同于大多数已报道的通过优化pegRNA提高引导编辑效率的思路，新型引导编辑系统ePPE侧重于对引导编辑系统的蛋白组分进行改造。通过对不同策略构建的多种引导编辑系统进行筛选，研究人员发现删除引导编辑系统中逆转录酶M-MLV RT（依赖RNA的DNA聚合酶）的RNA核酸酶H（RNase H）结构域或在M-MLV RT 的N端融合病毒核衣壳蛋白（NC），可分别将PPE的编辑效率提高2.0倍和3.2倍。
究其原因，他们推测，RNase H结构域的去除稳定了sgRNA-DNA和nCas9-RT-pegRNA复合体中的RNA-DNA异源双链结构，NC蛋白通过其核酸退火活性在逆转录过程中辅助MLV-RT发挥功能。
研究人员进一步地通过整合以上两种优化策略，开发出了升级版新型引导编辑器ePPE。相比于PPE，ePPE在碱基替换、小片段插入、删除以及较大片段的插入和删除等多种编辑类型下编辑效率平均可提高5.8倍，且不增加脱靶及副产物的发生。
“ePPE作为一个更高效、广适的引导编辑器，可以算作是一支流畅合格的‘铅笔’，一块干净好用的‘橡皮’了。”刘怡静表示。
对此，另一位审稿人也表示：“这项研究在植物基因组编辑领域做出了及时而重要的贡献。”
种质创新“小试牛刀”
除了高效和广适性，合作团队通过进一步研究发现，当把新型引导编辑器ePPE与该课题组此前报道的dual-pegRNA策略和哈佛大学、博德研究所教授刘如谦实验室研发的epegRNA策略相结合时，可进一步提高引导编辑系统在内源基因上进行精准编辑的效率。
这些特性在很大程度上拓展了其应用范围。基于此，研究人员利用ePPE系统成功创制了对两种除草剂（甲咪唑烟酸和烟嘧磺隆）具备抗性的水稻新材料。
刘怡静介绍，乙酰乳酸核酶（OsALS）基因是支链氨基酸合成途径中的第一个酶，诸如磺酰脲类、咪唑啉酮、三唑嘧啶等除草剂都是该酶的抑制剂，通过抑制支链氨基酸的合成导致植物死亡，从而除去很多杂草。同时，这类除草剂对哺乳动物毒性非常小，应用价值很高。
“通过在ALS基因的特定位置上产生单个氨基酸的突变，可以获得抗性酶，赋予植物这一类除草剂抗性。”她表示，研究团队选择了Trp548Met突变作为目标靶点，该位点突变虽然可通过传统诱变的方法获得，但耗时耗力，需要巨大的工作量。而使用基因编辑方法不存在像诱变产生的其他有害突变，没有脱靶，也无需回交，突变体植株可快速投入应用生产。
研究人员在这一位点将编码色氨酸的“TGG”密码子修改为编码甲硫氨酸的密码子“ATG”，通过“铅笔”+“橡皮擦”，同时实现“T到A”和“G到T”的突变。据介绍，这是目前引导编辑外的其他编辑工具所不能实现的。最终他们以高出原始引导编辑器PPE 5.6倍的效率成功获得了抗除草剂的水稻新材料，并且在甲咪唑烟酸和烟嘧磺隆两种除草剂的筛选下有非常好的抗性表型。
“我国虽然在动植物基因编辑技术研发和应用上居于世界前列，但原始专利严重缺位，核心专利及底层技术大多被美国为首的西方国家垄断，产业安全面临严重挑战，加快推动基因组编辑基础研究是国家发展和战略布局的迫切需求。”论文共同通讯作者、遗传发育所研究员曹晓风院士在接受《中国科学报》采访时曾说。
而新系统的开发有望推动引导编辑在农业育种、作物改良等方面的应用。“我们也期待有更加流畅的‘彩笔’不仅可以实现更长片段的精准改写，也可以精致的绘制改写基因组上的修饰，画出‘彩色’的基因组信息。”刘怡静说。
“这项工作论证充分且十分有趣。”一位审稿人写道，“引导编辑提供了对基因组进行定制化更改的能力，克服了碱基编辑器有限的替代能力。作者描述的引导编辑器可在植物基因组上将引导编辑效率提高数倍。”
“2.0时代”的引导编辑
在农业领域，基因组编辑技术可以更方便、快捷、精准地进行作物育种和改良。通过基因组编辑可以不添加任何外源性的基因，实现对基因组自身序列的修改，大大节省了时间和工作量。
事实上，基因组编辑技术从2012年诞生至今，经过10年的发展已经不仅仅是“一把剪刀”的概念。论文通讯作者、遗传发育所研究员高彩霞在接受《中国科学报》采访时介绍，进化至“2.0时代”的碱基编辑和引导编辑还可以是一块“橡皮”或一支“铅笔”。
“如果一个序列有点多，你可以把它剪掉；如果组成DNA的四个字母ATCG有一个错了，你可以像用一个‘橡皮擦’把它擦掉，然后用‘铅笔’写入正确字母，而‘铅笔’、‘橡皮擦’是不留在细胞里的。”她比喻说。
更具体地说，引导编辑系统（PE）是一种能够在基因组的靶位点处实现任意碱基替换和小片段精准删除、插入的新型基因组编辑工具，也是基因组编辑领域的重大变革。
2020年，高彩霞团队率先在水稻和小麦中成功建立并优化了适用于植物的引导编辑器（PPE），开发了植物引导编辑向导RNA（pegRNA）设计网站——PlantPegDesigner，极大提高了引导编辑效率并简化了植物pegRNA的设计流程。他们还通过全基因组重测序发现PPE系统在全基因组水平上具有很高的特异性。这些研究为引导编辑系统在植物领域的应用奠定了良好的基础。
尽管如此，引导编辑系统目前在植物中的编辑效率仍不够高，且有很大的靶点依赖性。“也就是说在一些内源靶位点上，现有的引导编辑系统效率仍然很低，尤其是针对一些较长片段的删除、插入这种复杂的编辑类型。”论文第一作者、高彩霞课题组博士生刘怡静向《中国科学报》解释。
这些短板严重限制了引导编辑在植物中的广泛应用。因此，如何优化引导编辑系统突破现有的限制，提升引导编辑技术的高效性、广适性是一个研究重点。
寻找更高效“突破点”
万事开头难。如何去优化引导编辑系统，实现更高效、广适的编辑呢？这是合作团队一直思考的问题。为此，他们先后构思尝试了多种不同策略，最终通过对蛋白的理性设计获得了能够稳定提高效率的ePPE的版本。
不同于大多数已报道的通过优化pegRNA提高引导编辑效率的思路，新型引导编辑系统ePPE侧重于对引导编辑系统的蛋白组分进行改造。通过对不同策略构建的多种引导编辑系统进行筛选，研究人员发现删除引导编辑系统中逆转录酶M-MLV RT（依赖RNA的DNA聚合酶）的RNA核酸酶H（RNase H）结构域或在M-MLV RT 的N端融合病毒核衣壳蛋白（NC），可分别将PPE的编辑效率提高2.0倍和3.2倍。
究其原因，他们推测，RNase H结构域的去除稳定了sgRNA-DNA和nCas9-RT-pegRNA复合体中的RNA-DNA异源双链结构，NC蛋白通过其核酸退火活性在逆转录过程中辅助MLV-RT发挥功能。
研究人员进一步地通过整合以上两种优化策略，开发出了升级版新型引导编辑器ePPE。相比于PPE，ePPE在碱基替换、小片段插入、删除以及较大片段的插入和删除等多种编辑类型下编辑效率平均可提高5.8倍，且不增加脱靶及副产物的发生。
“ePPE作为一个更高效、广适的引导编辑器，可以算作是一支流畅合格的‘铅笔’，一块干净好用的‘橡皮’了。”刘怡静表示。
对此，另一位审稿人也表示：“这项研究在植物基因组编辑领域做出了及时而重要的贡献。”
种质创新“小试牛刀”
除了高效和广适性，合作团队通过进一步研究发现，当把新型引导编辑器ePPE与该课题组此前报道的dual-pegRNA策略和哈佛大学、博德研究所教授刘如谦实验室研发的epegRNA策略相结合时，可进一步提高引导编辑系统在内源基因上进行精准编辑的效率。
这些特性在很大程度上拓展了其应用范围。基于此，研究人员利用ePPE系统成功创制了对两种除草剂（甲咪唑烟酸和烟嘧磺隆）具备抗性的水稻新材料。
刘怡静介绍，乙酰乳酸核酶（OsALS）基因是支链氨基酸合成途径中的第一个酶，诸如磺酰脲类、咪唑啉酮、三唑嘧啶等除草剂都是该酶的抑制剂，通过抑制支链氨基酸的合成导致植物死亡，从而除去很多杂草。同时，这类除草剂对哺乳动物毒性非常小，应用价值很高。
“通过在ALS基因的特定位置上产生单个氨基酸的突变，可以获得抗性酶，赋予植物这一类除草剂抗性。”她表示，研究团队选择了Trp548Met突变作为目标靶点，该位点突变虽然可通过传统诱变的方法获得，但耗时耗力，需要巨大的工作量。而使用基因编辑方法不存在像诱变产生的其他有害突变，没有脱靶，也无需回交，突变体植株可快速投入应用生产。
研究人员在这一位点将编码色氨酸的“TGG”密码子修改为编码甲硫氨酸的密码子“ATG”，通过“铅笔”+“橡皮擦”，同时实现“T到A”和“G到T”的突变。据介绍，这是目前引导编辑外的其他编辑工具所不能实现的。最终他们以高出原始引导编辑器PPE 5.6倍的效率成功获得了抗除草剂的水稻新材料，并且在甲咪唑烟酸和烟嘧磺隆两种除草剂的筛选下有非常好的抗性表型。
“我国虽然在动植物基因编辑技术研发和应用上居于世界前列，但原始专利严重缺位，核心专利及底层技术大多被美国为首的西方国家垄断，产业安全面临严重挑战，加快推动基因组编辑基础研究是国家发展和战略布局的迫切需求。”论文共同通讯作者、遗传发育所研究员曹晓风院士在接受《中国科学报》采访时曾说。
而新系统的开发有望推动引导编辑在农业育种、作物改良等方面的应用。“我们也期待有更加流畅的‘彩笔’不仅可以实现更长片段的精准改写，也可以精致的绘制改写基因组上的修饰，画出‘彩色’的基因组信息。”刘怡静说。
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