一代人杰诸葛亮八字分析 @ 混元道人
诸葛亮八字：辛丙癸丁
酉申丑巳
3乙未 13甲午 23癸巳 33壬辰 43辛卯 53庚寅
诸葛亮（181年农历七月二十三——234年农历八月二十八），字孔明，号卧龙（也作伏龙），汉族，琅琊阳都（今山东临沂市沂南县）人，三国时期蜀汉丞相，杰出的政治家、军事家、发明家、文学家。在世时被封为武乡侯，死后追谥忠武侯。后来东晋政权推崇诸葛亮军事才能，特追封他为武兴王。诸葛亮为匡扶蜀汉政权，呕心沥血、鞠躬尽瘁、死而后已。其代表作有《前出师表》、《后出师表》、《诫子书》等；曾发明木牛流马、孔明灯等。诸葛亮在后世受到极大的尊崇，成为后世忠臣楷模，智慧化身。成都有武侯祠，杜甫作千古名篇《蜀相》赞扬诸葛亮。
提起诸葛亮家喻户晓，一代名相，帮刘备打天下，鞠躬尽瘁，万世流芳；其出师表，隆中对，空城计等，无不显示其高超智慧。网上点评诸葛丞相命理的理论众说纷纭，各有各的理由，其说服力都是恰到好处，最为典型的名家袁树珊老前辈更是独特；下面针对已知的情况进行解读。
分析：癸水盘根在丑，生在申月，金强结党，喜丙丁火盘根在巳克制印旺。印格在身印两强的情况下本喜食伤解救，然此造食伤不现，且财星两透；印格本不喜财星，怕财来破印，好在印重用财，但是印格八字在用财的情况下，财要轻，财不能双透也不能多根，即财不能太强，否则会破坏格局；妙在丙辛合，格之成矣。
格局提要：1，印重带财，天干双财星，喜暗藏的壬癸辛水去财。
2，原局的核心在丑，其丑不可破坏，丑是癸水唯一的盘根之支，失去丑、癸水不能得印所生，且被易遭到火金所伤。
3，印格带财用比劫制财只是原则问题，或干或支有二印方可用劫，否则只宜官印之大运，反忌比劫。
4，印格在带财的情况下，而财双透或双根，最忌食伤生财破格，为格之大忌矣。5，原局的丙辛合，金过重为忌，而财过重或双透财星是格局之忌，妙哉丙辛合其意在水，一合解两忌反为用矣。
诸葛亮在九岁的时候丧母：九岁是己巳的乙未运，先看原局，辛酉年命纳音属木，生在申金之月，是提纲克年，父母不全。且坐下金库，即印之库，库者墓也，大运乙未是未冲印的墓库主丧母，而己巳流年是丧母的应期。为什么呢，原局与岁运有乙己丁三干透，乙己丁可以邀请未土出来，均来自未中；而己巳的己是未的本气，己到组合成乙己丁即是未到，是引动未冲丑的时候，打开墓库，引起酉金入墓。同时流年的巳申合，引起辛酉近距离的入墓，均是丧母的象。
诸葛亮在十二岁的时候丧父：即己巳运的壬申年，原局与大运的丑未冲引起巳申刑合，辛是母，那丙即是父，壬申年的进入是引动巳申刑合，申中的壬克制了巳中的丙，这个必须要壬透方符合条件，丙巳干冲支刑合，主丧父矣。
诸葛亮十七岁的时候收养的叔父死了：即是甲午运的丁丑年，丙为父，丁是父的兄弟姐妹，丁即是叔父。先来解释下为什么是叔父收养，癸盘根在丑，丑是金库印库，即是安身之处，为家，为身体库；丁是叔父，丁坐巳火之上，巳丑合，可以理解照顾癸的身体，即照顾诸葛亮，同时照顾丑也是丁的墓，墓可当丁的家，可以理解癸坐在丁的家上，即是被丁所收养的象。那么甲午运的丁丑年，大运与原局组合成丑午穿，引起巳申刑克，丁丑是引动丑午穿，且丁直接坐下墓库，丑午的穿是打开墓库，丁火入墓而死，即此年叔父了。
诸葛亮二十七岁得刘备三顾茅庐出山：即癸巳运的丁亥年，年柱的辛金代表刘备，辛坐酉上，酉是将星，三军之统帅，亥是金的食伤星，即是刘备的智慧，同时也是癸水的刃，二巳不怕一亥冲，巳亥冲反而是冲出巳中的丙火去合辛，即是获得了辛金刘备统帅的赏识重用；巳中的丙透出是我宫的一种求名的工具，辛金是印是名是权，巳火透出的丙是想得到辛金的名与权，要说明一下的是，年柱的辛金是坐下将星，并且强旺，非不一般的名与权。既然辛是统帅，那么金主义，即是仁义之人，也仁义之师呀。我宫的巳中的丙是工具，在癸巳运中，巳到丙到，工具得到了发挥，而丁亥年只不过是应期，巳亥冲丙是工具得到发挥，使展自己的才华的时候到了。同时也可以利见大人，巳是贵人，巳亥冲出丙合辛，即是利见大人，可以说刘备是诸葛亮的贵人。
诸葛亮二十九岁任命军师中郎将：即是癸巳运的己丑年，前面提到了酉是将星，巳丙是自己的一种求名求权的工具，癸巳运是工具得到了发挥，发挥了但是什么时候得到酉金的权力呢？即是己丑年，巳丑的原局，巳是工具丑是将星的库，即是三军的库，巳火意在得到丑，丑到就是权到，前面格局论分析丑是原局的核心所在，癸水的盘根之支，己丑是巳火得到了丑，即获得的权力，拥有指挥三军的令牌。
诸葛亮四十一岁任命丞相：即大运壬辰流年辛丑，壬辰运在格局论中的印格带财重喜比劫制财，即是好运，壬辰同时也是辛金刘备的好运，在此时的丑是可以代表蜀国的，蜀是西南，即金，丑是金库，是蜀国。辛丑年辛金刘备在大运去官杀的时候，伏吟坐在丑上，即是得到了蜀国，成为一国之主。那么对诸葛亮来看，丑是蜀国，而辛金是蜀国的印，也是刘备，丙辛金是我方的工具得到了刘备的赏识，得到了蜀国的印，且是一国之印，丑即是蜀国也是将星的权力，丙巳均是合辛丑，是获得了丞相之职的象。
四十三岁蜀国之主刘备病死在白帝城：即大运辛卯流年在癸卯，辛卯大运与年柱成天比地冲，以支所冲所属论星，卯木冲的是辛金之禄，即是刘备的身体，癸卯年是引动卯酉，故有此象矣。
四十七岁诸葛亮出师北伐：即是大运辛卯流年在丁未，辛卯大运虽然是卯酉冲，但是这个冲是冲出酉中的辛金与丙合，将星虽冲，也即是得到兵权，一国之权，权倾朝野的象。而丁未年与癸丑天克地冲，未是食伤库是智慧库，是诸葛亮指挥丑库的时候，丑即是蜀国，也是三军，冲可以动，走动，冲丑库是调动三军的象，指挥三军，也即有了北伐的象，但是出师不利，未能成功，必定丁未年是财星破印，这个印即是辛金也是兵，有损兵折将的象矣。
四十八岁降为右将军、失街亭、斩马谡：即大运辛卯流年戊申，辛卯的大运前面提到了，是冲出辛金的权力，令牌。但是戊申运是巳申合，我宫的求权求名的工具有所变化，巳申的合引起巳火合丑不专，虽是降职，必定癸水还是坐在丑上，丙火还是得到了辛金，表面降职，实际依旧握兵权。斩马谡可以把丁当马谡，丁的禄在午，午是马，马是马谡，丙是自己主要的是事业工具，而丁好像是副的，这个丁能帮到自己吗，显然是不能，戊申年是丁的败地，是马谡引起的战败，戊辛丁的组合有暗邀戌的象，戌丑刑是斩马谡的关键。
五十四岁诸葛亮病死在五丈原：即大运庚寅流年甲寅，庚寅与月令的丙申成天克地冲，并且也是巳申寅的三刑之运，而印格带财双透，最忌就是食伤星，甲寅流年是强旺的食伤星生财破印，格之大破。同时引动天克地冲，这个引动导致了丁火帮扶克制辛金的象，印是身体，格破，大凶矣。印格财双透，逢食伤生财破印，命丧黄泉。
(づ ●─● )づ
释式：
枭神，辛10分气酉10分气，枭神
正财，丙05分气申30分气，印绶
日主，癸10分气丑06分气，杀刃
偏财，丁06分气巳06分气。偏财
巳酉丑三合化金在申月，丙丁无气力可图！从旺八字辛枭神为用的<一代枭雄>！
金水旺相主智慧的化身！！！
然而丙丁夹身，气血暗耗而早夭！
癸坐丑上，十二支中一个丑妻！好在巳酉丑合化金气生助：为教师资格矣！！！孔明怕老婆也！！！
而癸日主坐丑伏刃又是七杀，才是将相全才之因也！！！
只是人生癸日主生申月：生不逢时！绝气逢生之月！！！癸见未月入墓，申月绝气。其中玄妙几人识？
言此为从旺，其实是身弱而为也！！！徒有虚势，不堪重负也！！！
其实，他逝世于五十五岁乙卯年，庚寅大运，寅冲申，不会有三刑！因巳酉丑化金气也！！！甲寅年二寅冲申，还有辛合丙耗丁<庚克甲不破坏八字干组合体>，二寅虚忌神并见无凶！虽冲申而无死之凶兆！
乙卯年，乙庚合绊，寅冲申，卯冲酉，八字中巳酉丑三合化气局破！巳归本位本气大助丁而旺耗癸日主<心血不济>！丑杀性急而燥且伏刃刚强！！！
申酉逢冲，辛无根气，怎敌丙丁夹击？
且老来见长生沐浴，再生再造兮！ https://t.cn/RyhYFYz
诸葛亮八字：辛丙癸丁
酉申丑巳
3乙未 13甲午 23癸巳 33壬辰 43辛卯 53庚寅
诸葛亮（181年农历七月二十三——234年农历八月二十八），字孔明，号卧龙（也作伏龙），汉族，琅琊阳都（今山东临沂市沂南县）人，三国时期蜀汉丞相，杰出的政治家、军事家、发明家、文学家。在世时被封为武乡侯，死后追谥忠武侯。后来东晋政权推崇诸葛亮军事才能，特追封他为武兴王。诸葛亮为匡扶蜀汉政权，呕心沥血、鞠躬尽瘁、死而后已。其代表作有《前出师表》、《后出师表》、《诫子书》等；曾发明木牛流马、孔明灯等。诸葛亮在后世受到极大的尊崇，成为后世忠臣楷模，智慧化身。成都有武侯祠，杜甫作千古名篇《蜀相》赞扬诸葛亮。
提起诸葛亮家喻户晓，一代名相，帮刘备打天下，鞠躬尽瘁，万世流芳；其出师表，隆中对，空城计等，无不显示其高超智慧。网上点评诸葛丞相命理的理论众说纷纭，各有各的理由，其说服力都是恰到好处，最为典型的名家袁树珊老前辈更是独特；下面针对已知的情况进行解读。
分析：癸水盘根在丑，生在申月，金强结党，喜丙丁火盘根在巳克制印旺。印格在身印两强的情况下本喜食伤解救，然此造食伤不现，且财星两透；印格本不喜财星，怕财来破印，好在印重用财，但是印格八字在用财的情况下，财要轻，财不能双透也不能多根，即财不能太强，否则会破坏格局；妙在丙辛合，格之成矣。
格局提要：1，印重带财，天干双财星，喜暗藏的壬癸辛水去财。
2，原局的核心在丑，其丑不可破坏，丑是癸水唯一的盘根之支，失去丑、癸水不能得印所生，且被易遭到火金所伤。
3，印格带财用比劫制财只是原则问题，或干或支有二印方可用劫，否则只宜官印之大运，反忌比劫。
4，印格在带财的情况下，而财双透或双根，最忌食伤生财破格，为格之大忌矣。5，原局的丙辛合，金过重为忌，而财过重或双透财星是格局之忌，妙哉丙辛合其意在水，一合解两忌反为用矣。
诸葛亮在九岁的时候丧母：九岁是己巳的乙未运，先看原局，辛酉年命纳音属木，生在申金之月，是提纲克年，父母不全。且坐下金库，即印之库，库者墓也，大运乙未是未冲印的墓库主丧母，而己巳流年是丧母的应期。为什么呢，原局与岁运有乙己丁三干透，乙己丁可以邀请未土出来，均来自未中；而己巳的己是未的本气，己到组合成乙己丁即是未到，是引动未冲丑的时候，打开墓库，引起酉金入墓。同时流年的巳申合，引起辛酉近距离的入墓，均是丧母的象。
诸葛亮在十二岁的时候丧父：即己巳运的壬申年，原局与大运的丑未冲引起巳申刑合，辛是母，那丙即是父，壬申年的进入是引动巳申刑合，申中的壬克制了巳中的丙，这个必须要壬透方符合条件，丙巳干冲支刑合，主丧父矣。
诸葛亮十七岁的时候收养的叔父死了：即是甲午运的丁丑年，丙为父，丁是父的兄弟姐妹，丁即是叔父。先来解释下为什么是叔父收养，癸盘根在丑，丑是金库印库，即是安身之处，为家，为身体库；丁是叔父，丁坐巳火之上，巳丑合，可以理解照顾癸的身体，即照顾诸葛亮，同时照顾丑也是丁的墓，墓可当丁的家，可以理解癸坐在丁的家上，即是被丁所收养的象。那么甲午运的丁丑年，大运与原局组合成丑午穿，引起巳申刑克，丁丑是引动丑午穿，且丁直接坐下墓库，丑午的穿是打开墓库，丁火入墓而死，即此年叔父了。
诸葛亮二十七岁得刘备三顾茅庐出山：即癸巳运的丁亥年，年柱的辛金代表刘备，辛坐酉上，酉是将星，三军之统帅，亥是金的食伤星，即是刘备的智慧，同时也是癸水的刃，二巳不怕一亥冲，巳亥冲反而是冲出巳中的丙火去合辛，即是获得了辛金刘备统帅的赏识重用；巳中的丙透出是我宫的一种求名的工具，辛金是印是名是权，巳火透出的丙是想得到辛金的名与权，要说明一下的是，年柱的辛金是坐下将星，并且强旺，非不一般的名与权。既然辛是统帅，那么金主义，即是仁义之人，也仁义之师呀。我宫的巳中的丙是工具，在癸巳运中，巳到丙到，工具得到了发挥，而丁亥年只不过是应期，巳亥冲丙是工具得到发挥，使展自己的才华的时候到了。同时也可以利见大人，巳是贵人，巳亥冲出丙合辛，即是利见大人，可以说刘备是诸葛亮的贵人。
诸葛亮二十九岁任命军师中郎将：即是癸巳运的己丑年，前面提到了酉是将星，巳丙是自己的一种求名求权的工具，癸巳运是工具得到了发挥，发挥了但是什么时候得到酉金的权力呢？即是己丑年，巳丑的原局，巳是工具丑是将星的库，即是三军的库，巳火意在得到丑，丑到就是权到，前面格局论分析丑是原局的核心所在，癸水的盘根之支，己丑是巳火得到了丑，即获得的权力，拥有指挥三军的令牌。
诸葛亮四十一岁任命丞相：即大运壬辰流年辛丑，壬辰运在格局论中的印格带财重喜比劫制财，即是好运，壬辰同时也是辛金刘备的好运，在此时的丑是可以代表蜀国的，蜀是西南，即金，丑是金库，是蜀国。辛丑年辛金刘备在大运去官杀的时候，伏吟坐在丑上，即是得到了蜀国，成为一国之主。那么对诸葛亮来看，丑是蜀国，而辛金是蜀国的印，也是刘备，丙辛金是我方的工具得到了刘备的赏识，得到了蜀国的印，且是一国之印，丑即是蜀国也是将星的权力，丙巳均是合辛丑，是获得了丞相之职的象。
四十三岁蜀国之主刘备病死在白帝城：即大运辛卯流年在癸卯，辛卯大运与年柱成天比地冲，以支所冲所属论星，卯木冲的是辛金之禄，即是刘备的身体，癸卯年是引动卯酉，故有此象矣。
四十七岁诸葛亮出师北伐：即是大运辛卯流年在丁未，辛卯大运虽然是卯酉冲，但是这个冲是冲出酉中的辛金与丙合，将星虽冲，也即是得到兵权，一国之权，权倾朝野的象。而丁未年与癸丑天克地冲，未是食伤库是智慧库，是诸葛亮指挥丑库的时候，丑即是蜀国，也是三军，冲可以动，走动，冲丑库是调动三军的象，指挥三军，也即有了北伐的象，但是出师不利，未能成功，必定丁未年是财星破印，这个印即是辛金也是兵，有损兵折将的象矣。
四十八岁降为右将军、失街亭、斩马谡：即大运辛卯流年戊申，辛卯的大运前面提到了，是冲出辛金的权力，令牌。但是戊申运是巳申合，我宫的求权求名的工具有所变化，巳申的合引起巳火合丑不专，虽是降职，必定癸水还是坐在丑上，丙火还是得到了辛金，表面降职，实际依旧握兵权。斩马谡可以把丁当马谡，丁的禄在午，午是马，马是马谡，丙是自己主要的是事业工具，而丁好像是副的，这个丁能帮到自己吗，显然是不能，戊申年是丁的败地，是马谡引起的战败，戊辛丁的组合有暗邀戌的象，戌丑刑是斩马谡的关键。
五十四岁诸葛亮病死在五丈原：即大运庚寅流年甲寅，庚寅与月令的丙申成天克地冲，并且也是巳申寅的三刑之运，而印格带财双透，最忌就是食伤星，甲寅流年是强旺的食伤星生财破印，格之大破。同时引动天克地冲，这个引动导致了丁火帮扶克制辛金的象，印是身体，格破，大凶矣。印格财双透，逢食伤生财破印，命丧黄泉。
(づ ●─● )づ
释式：
枭神，辛10分气酉10分气，枭神
正财，丙05分气申30分气，印绶
日主，癸10分气丑06分气，杀刃
偏财，丁06分气巳06分气。偏财
巳酉丑三合化金在申月，丙丁无气力可图！从旺八字辛枭神为用的<一代枭雄>！
金水旺相主智慧的化身！！！
然而丙丁夹身，气血暗耗而早夭！
癸坐丑上，十二支中一个丑妻！好在巳酉丑合化金气生助：为教师资格矣！！！孔明怕老婆也！！！
而癸日主坐丑伏刃又是七杀，才是将相全才之因也！！！
只是人生癸日主生申月：生不逢时！绝气逢生之月！！！癸见未月入墓，申月绝气。其中玄妙几人识？
言此为从旺，其实是身弱而为也！！！徒有虚势，不堪重负也！！！
其实，他逝世于五十五岁乙卯年，庚寅大运，寅冲申，不会有三刑！因巳酉丑化金气也！！！甲寅年二寅冲申，还有辛合丙耗丁<庚克甲不破坏八字干组合体>，二寅虚忌神并见无凶！虽冲申而无死之凶兆！
乙卯年，乙庚合绊，寅冲申，卯冲酉，八字中巳酉丑三合化气局破！巳归本位本气大助丁而旺耗癸日主<心血不济>！丑杀性急而燥且伏刃刚强！！！
申酉逢冲，辛无根气，怎敌丙丁夹击？
且老来见长生沐浴，再生再造兮！ https://t.cn/RyhYFYz
大家好,我是你们的科普达人小V，上一期我们主要讲细胞凋亡TUNEL的检测方法和实验操作注意点，这次我们来唠一唠凋亡检测的另一个大头——Annexin V法流式凋亡检测。
我们先来回忆一下上期中讲的Annexin V凋亡检测原理：
凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）会从膜内翻到膜外，这是凋亡的一个典型特征，细胞凋亡处于早期阶段时，仅有PS外翻，而细胞膜仍然完整，随着凋亡进程的推移，细胞除了PS外翻以外，细胞膜通透性会改变，可以简单的理解成凋亡后期，细胞膜有穿孔的现象。
接下来我们再来看一下试剂，我们以最常见的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例，试剂盒内一般都是3个组分：两个染料，再加一个为Annexin V标记提供钙离子环境的Binding Buffer。Annexin V本质是一个在钙离子环境下，能够与磷脂酰丝氨酸高度特异性结合的膜联蛋白，通过在该蛋白上标记的荧光基团，我们就可以标记凋亡细胞了，然后再搭配只能够进入受损细胞膜的核酸染料，就可以达到区分各阶段细胞的目的了。
我们将细胞分为三类：一是无PS外翻，也没有细胞膜破裂的健康细胞（两个染料都染不上），二是处于早期凋亡，有PS外翻但是细胞膜完好的细胞（可以染上Annexin V-FITC,不能够染上PI），三是处于晚期凋亡阶段，既存在PS外翻，也存在细胞膜破裂的晚期凋亡细胞（两种染料均可染上），第四类较为特殊，不做赘述，它是无PS外翻但是细胞膜受损的细胞，一般认为这是坏死细胞（可以染上PI，但是无法染上Annexin V-FITC）。
染完色后通过流式细胞仪，我们就能够对细胞群体进行定量和分析了。
以上就是Annexin V法检测凋亡的原理，怎么样是不是超简单~接下来我们来看一下这个实验本身，如何顺利的攻克这个检测呢？
硬核技术一：
细胞收集与染色——如何规范化操作？
Annexin V法的检测主体是流式细胞仪，因此样品必须处理成悬浮细胞的形式才可以上机检测。如果是细胞样品，悬浮细胞直接计数，贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化成细胞悬液后进行后续操作；如果样本是组织，那么需要将其消化成细胞悬液才可以进行后续的实验步骤。
染色操作就非常的简单了，可以概括成以下几步：
（1） 细胞收集，PBS洗涤
（2） Binding Buffer重悬
（3） 染色
（4） 流式检测
一般建议大家收集105个细胞进入洗涤、染色步骤，洗涤时用预冷的PBS洗两遍，然后将PBS吸干净，用Binding Buffer重悬后进行染色，染色时两种染料各加5 µl，避光染色10 min即可终止。
这里要特别提醒一下大家，染色时间不建议延长，避免造成假阳性影响实验结果分析。
硬核技术二：
实验设计——我该拿这么多对照组怎么办？
流式的对照一直很令人头疼，今天小V就来为大家解答一下疑惑。
流式上机除了实验组的双染组之外，还需要添加一系列的对照，用于仪器荧光补偿的调整和后续的数据分析。我们可以将这些对照分为3类。
（1） 空白对照：不进行标记的裸细胞，一般选用待测实验组细胞。目的是看经处理后，细胞本身物理状态是否有变化，也用以进行细胞选群和阴性细胞大致位置的确定。
（2） 阴性对照：双染的不处理正常细胞，目的是排除细胞自身凋亡以及因操作过程带来的凋亡和坏死。另外，健康细胞分界线确定建议用这个对照，因为双染健康细胞相对于不染健康细胞会存在一定的荧光偏移。
（3） 单标组：单一染料标记的实验组细胞（有凋亡细胞）。这一个组别主要是用来进行荧光补偿的调节。流式检测中，荧光信号除了接收通道以外，还可能被另一通道接收到，影响该通道的数据，因此需要进行“补偿调节”，扣除该染料对其他荧光通道的影响。单标组有几种染料就应该做几管，所使用样本应该是该染料检测时，细胞能够有明显区分度的样本。
硬核技术三：
数据分析——救救孩子，怎么搞分析啊？
流式数据的分析是这个实验的重中之重了，我们应该如何操作，才能够得到漂亮的图呢？
首先，我们来认识一下流式分析的检测原理：流式细胞仪通道中一个个的样本流过，仪器会给它一个激发光，这个样本给出的发射光被流式的不同通道所接收，反映在图上就是下图所示的一个个小点（smooth图不以小点的形式显示），这边需要强调的是，流式通道一个个通过去的样品，不一定全是细胞，体系内的细胞碎片，各种小分子杂质只要能够被流式检测到，反映在图谱上，就是一个点。所以严格来说，流式图谱中的点，每个点代表的是一个事件。一般分析我们建议上机时至少采集10000个事件，我们认为这个是能够满足统计学样本分析量的基本要求的。
凋亡数据分析有三个重要步骤：画门、调补偿、画十字门。
1、画门
流式分析给出的第一个图谱，是FSC-SSC物理图谱（图a），这边是小V做的一个凋亡细胞样品，使用 Vazyme #A211 Annexin V-FITC/PI染色，上机分析。首先得到的是图a的FSC-SSC物理图谱，这是之后所有分析的基础。
横纵坐标轴FSC（前向角散射）和SSC（侧向角散射）分别代表了细胞大小和细胞颗粒度，通过这个图谱，我们能根据细胞大小、颗粒度做一个分类。这个分类有两个作用，一是如果两种细胞群在一起，细胞有明显的形态区别，可以做初步的分类，另一个重要作用是可以区分细胞与细胞碎片，如图a所示，我们能够看到很明显的两个群，右上方一群，左下角有一群大小和颗粒度都非常低的事件群体，这一群与右上群体具有明显区分度的事件，被判定为细胞碎片，是必须在后续分析中排除出去的。
为什么一定要出去细胞碎片再进行后续分析呢？
大家可以看图b和图d，图b是图a中所有事件全部划入后续分析得到的结果，图d是把图c中的细胞碎片排除以后进行分析得到的结果。很明显图d的分群比图b优秀太多，细胞碎片真的是一个及其影响分群的东西。
小V要专门另起一行来跟大家强调一下：细胞碎片，请尽力把它排除出你的分析范围！！！
好了，告一段落，搞定了基础的FSC-SSC图谱，成功选到了我们要分析的细胞，也就是做好了第一步：画门。我们接下来应该做什么呢？
2、调补偿
现在的流式细胞仪，调补偿的方法各有不同，有直接上机的时候跑个单染管，仪器自动给你调整好的，也有仪器万事不管，你自己跑完所有样本，回头吭哧吭哧自己做调节的。前者我们就不讲了，我们来讲一讲后者。
首先，必须调节补偿，细胞被激发出来的荧光除了被你设置的那个接收通道接收以外，还有一部分光会逸散到其他通道当中。用FITC作为例子，大家可以看下边这个表格：目标接收通道FL1只能接收到80 %的光，还有20 %散布在其他通道，FL2通道高达10 %，因此不扣除这部分荧光，对你数据分析的影响是非常大的。这个扣除某一荧光素误入到其他荧光通道中的信号的操作，就叫做“调节荧光补偿”。
实验中用到几种荧光，就要准备几种单染管！！
唠完前边这些理论内容，我们来说点实在的。在凋亡实验中，我们如何来调节荧光补偿呢？
这边小V推荐大家拿到原始数据以后，用Flowjo V10进行荧光补偿的调节，软件自动，不用发愁～这个操作分为3步
（1） 在FSC-SSC图中，选出待分析细胞群，一定尽量扔掉细胞碎片！
（2） 打开Flowjo的补偿调节界面，按需选择样品、阴性、阳性。Positive一般软件会自动选择，大家不用在意，请重点关注Sample和Negative，Sample是你的单染管，Negative指的是不含该染料的体系，一般统一用不染色的对照组就行了。
（3） 请点击Apply to Group按钮，选中对应的数据组，简单模式的你的补偿就已经OK了~
3、画十字门
最后呢我们来唠一下关于结果怎么看的那些事儿~
我们通过十字门，将细胞分为了四个象限（见图4），分别对应了四种不同的染色情况，左下象限是两个染料都没染到的健康细胞，右下是染上了Annexin V-FITC，没染上PI的早期凋亡细胞，右上象限我们一般情况下把它判定为晚期凋亡细胞（FITC和PI都能染上），但实际情况中，右上象限也是包括了一部分坏死细胞的，但是比例比较小，一般是忽略掉的。左上象限是坏死细胞（不经凋亡，因此没有PS外翻，但是细胞坏死后细胞膜损坏，因此核酸染料可以进入）。
讲完了结果的四个象限划分，我们回到四个象限本身，这个十字门该怎么画呢？
这边小V给到大家一个最优的画法~大家可以掏出你调节好补偿的数据，找出两个单染组，然后根据单染组的分群大致画出横纵坐标轴的荧光强度分界，然后在双染的数据中以这两个分界为基准，结合数据的实际分群情况进行微调，就是属于你数据的十字门了~这边也是强调一下，需要一起分析的数据们，都必须用统一的十字门哟！
最后，有几个点需要补充说明一下，也是大家经常遇到的一些问题：
1. 我的细胞贴壁非常的厉害，不含EDTA胰酶我都得消化个15、20分钟，怎么办？
遇到这种情况，小V建议你两害相权取其轻，Binding Buffer里最重要的组分是钙离子，建议大家用不含EDTA的胰酶是因为EDTA螯合剂会把钙离子扯下来，降低Annexin V的标记效率。但是如果消化要花费15分钟甚至更久，会引入很多机械性损伤，对于数据分析有很大的影响。所以这种时候用含EDTA的胰酶也是可以的，但是后续一定要洗涤干净。
2. 我能不能延长染色时间啊？我觉得10分钟染色，好像染得不够多啊？
不可以的哦，10分钟是最优化的染色时间，染色时间过长的情况下会产生假阳性，不利于真实的实验结果分析。
3. 我的细胞因为种种原因，就是没办法好好分群，我该怎么画门呢？
这里首先要同情一下这位同学，然后要告诉大家，遇到这种情况，可做一个健康细胞双染（同一份健康细胞，加染料与不加染料，其本底荧光值会有偏移，因此这边必须进行双染），健康细胞肯定是染不上染料的，那么你就得到了一团在左下角的细胞，以一团细胞的边界为标准画十字门，然后统一用这个十字门就可以了。
4. 我这边没有流式，我该在哪里停止实验啊？
收集好细胞后，经PBS洗涤并用Binding Buffer重悬，放置在冰上去平台处染色然后上机即可。中间时间不宜过长，否则细胞状态容易变差。
友情提醒：如果细胞本身凋亡就非常多，那么转移过程可能导致细胞状态急速变差。因此需要根据细胞本身特性和药物处理后细胞状态进行综合判断，建议针对不同实验条件开展优化。
好啦~今天的课小V就讲到这里了，如果大家在实验方面有任何疑问， 欢迎随时咨询小V，或直接联系您身边的诺唯赞人，我们将努力为您提供更优质的产品和服务！最后，祝福大家实验顺当结果好，细胞超乖不作妖！
我们先来回忆一下上期中讲的Annexin V凋亡检测原理：
凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）会从膜内翻到膜外，这是凋亡的一个典型特征，细胞凋亡处于早期阶段时，仅有PS外翻，而细胞膜仍然完整，随着凋亡进程的推移，细胞除了PS外翻以外，细胞膜通透性会改变，可以简单的理解成凋亡后期，细胞膜有穿孔的现象。
接下来我们再来看一下试剂，我们以最常见的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例，试剂盒内一般都是3个组分：两个染料，再加一个为Annexin V标记提供钙离子环境的Binding Buffer。Annexin V本质是一个在钙离子环境下，能够与磷脂酰丝氨酸高度特异性结合的膜联蛋白，通过在该蛋白上标记的荧光基团，我们就可以标记凋亡细胞了，然后再搭配只能够进入受损细胞膜的核酸染料，就可以达到区分各阶段细胞的目的了。
我们将细胞分为三类：一是无PS外翻，也没有细胞膜破裂的健康细胞（两个染料都染不上），二是处于早期凋亡，有PS外翻但是细胞膜完好的细胞（可以染上Annexin V-FITC,不能够染上PI），三是处于晚期凋亡阶段，既存在PS外翻，也存在细胞膜破裂的晚期凋亡细胞（两种染料均可染上），第四类较为特殊，不做赘述，它是无PS外翻但是细胞膜受损的细胞，一般认为这是坏死细胞（可以染上PI，但是无法染上Annexin V-FITC）。
染完色后通过流式细胞仪，我们就能够对细胞群体进行定量和分析了。
以上就是Annexin V法检测凋亡的原理，怎么样是不是超简单~接下来我们来看一下这个实验本身，如何顺利的攻克这个检测呢？
硬核技术一：
细胞收集与染色——如何规范化操作？
Annexin V法的检测主体是流式细胞仪，因此样品必须处理成悬浮细胞的形式才可以上机检测。如果是细胞样品，悬浮细胞直接计数，贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化成细胞悬液后进行后续操作；如果样本是组织，那么需要将其消化成细胞悬液才可以进行后续的实验步骤。
染色操作就非常的简单了，可以概括成以下几步：
（1） 细胞收集，PBS洗涤
（2） Binding Buffer重悬
（3） 染色
（4） 流式检测
一般建议大家收集105个细胞进入洗涤、染色步骤，洗涤时用预冷的PBS洗两遍，然后将PBS吸干净，用Binding Buffer重悬后进行染色，染色时两种染料各加5 µl，避光染色10 min即可终止。
这里要特别提醒一下大家，染色时间不建议延长，避免造成假阳性影响实验结果分析。
硬核技术二：
实验设计——我该拿这么多对照组怎么办？
流式的对照一直很令人头疼，今天小V就来为大家解答一下疑惑。
流式上机除了实验组的双染组之外，还需要添加一系列的对照，用于仪器荧光补偿的调整和后续的数据分析。我们可以将这些对照分为3类。
（1） 空白对照：不进行标记的裸细胞，一般选用待测实验组细胞。目的是看经处理后，细胞本身物理状态是否有变化，也用以进行细胞选群和阴性细胞大致位置的确定。
（2） 阴性对照：双染的不处理正常细胞，目的是排除细胞自身凋亡以及因操作过程带来的凋亡和坏死。另外，健康细胞分界线确定建议用这个对照，因为双染健康细胞相对于不染健康细胞会存在一定的荧光偏移。
（3） 单标组：单一染料标记的实验组细胞（有凋亡细胞）。这一个组别主要是用来进行荧光补偿的调节。流式检测中，荧光信号除了接收通道以外，还可能被另一通道接收到，影响该通道的数据，因此需要进行“补偿调节”，扣除该染料对其他荧光通道的影响。单标组有几种染料就应该做几管，所使用样本应该是该染料检测时，细胞能够有明显区分度的样本。
硬核技术三：
数据分析——救救孩子，怎么搞分析啊？
流式数据的分析是这个实验的重中之重了，我们应该如何操作，才能够得到漂亮的图呢？
首先，我们来认识一下流式分析的检测原理：流式细胞仪通道中一个个的样本流过，仪器会给它一个激发光，这个样本给出的发射光被流式的不同通道所接收，反映在图上就是下图所示的一个个小点（smooth图不以小点的形式显示），这边需要强调的是，流式通道一个个通过去的样品，不一定全是细胞，体系内的细胞碎片，各种小分子杂质只要能够被流式检测到，反映在图谱上，就是一个点。所以严格来说，流式图谱中的点，每个点代表的是一个事件。一般分析我们建议上机时至少采集10000个事件，我们认为这个是能够满足统计学样本分析量的基本要求的。
凋亡数据分析有三个重要步骤：画门、调补偿、画十字门。
1、画门
流式分析给出的第一个图谱，是FSC-SSC物理图谱（图a），这边是小V做的一个凋亡细胞样品，使用 Vazyme #A211 Annexin V-FITC/PI染色，上机分析。首先得到的是图a的FSC-SSC物理图谱，这是之后所有分析的基础。
横纵坐标轴FSC（前向角散射）和SSC（侧向角散射）分别代表了细胞大小和细胞颗粒度，通过这个图谱，我们能根据细胞大小、颗粒度做一个分类。这个分类有两个作用，一是如果两种细胞群在一起，细胞有明显的形态区别，可以做初步的分类，另一个重要作用是可以区分细胞与细胞碎片，如图a所示，我们能够看到很明显的两个群，右上方一群，左下角有一群大小和颗粒度都非常低的事件群体，这一群与右上群体具有明显区分度的事件，被判定为细胞碎片，是必须在后续分析中排除出去的。
为什么一定要出去细胞碎片再进行后续分析呢？
大家可以看图b和图d，图b是图a中所有事件全部划入后续分析得到的结果，图d是把图c中的细胞碎片排除以后进行分析得到的结果。很明显图d的分群比图b优秀太多，细胞碎片真的是一个及其影响分群的东西。
小V要专门另起一行来跟大家强调一下：细胞碎片，请尽力把它排除出你的分析范围！！！
好了，告一段落，搞定了基础的FSC-SSC图谱，成功选到了我们要分析的细胞，也就是做好了第一步：画门。我们接下来应该做什么呢？
2、调补偿
现在的流式细胞仪，调补偿的方法各有不同，有直接上机的时候跑个单染管，仪器自动给你调整好的，也有仪器万事不管，你自己跑完所有样本，回头吭哧吭哧自己做调节的。前者我们就不讲了，我们来讲一讲后者。
首先，必须调节补偿，细胞被激发出来的荧光除了被你设置的那个接收通道接收以外，还有一部分光会逸散到其他通道当中。用FITC作为例子，大家可以看下边这个表格：目标接收通道FL1只能接收到80 %的光，还有20 %散布在其他通道，FL2通道高达10 %，因此不扣除这部分荧光，对你数据分析的影响是非常大的。这个扣除某一荧光素误入到其他荧光通道中的信号的操作，就叫做“调节荧光补偿”。
实验中用到几种荧光，就要准备几种单染管！！
唠完前边这些理论内容，我们来说点实在的。在凋亡实验中，我们如何来调节荧光补偿呢？
这边小V推荐大家拿到原始数据以后，用Flowjo V10进行荧光补偿的调节，软件自动，不用发愁～这个操作分为3步
（1） 在FSC-SSC图中，选出待分析细胞群，一定尽量扔掉细胞碎片！
（2） 打开Flowjo的补偿调节界面，按需选择样品、阴性、阳性。Positive一般软件会自动选择，大家不用在意，请重点关注Sample和Negative，Sample是你的单染管，Negative指的是不含该染料的体系，一般统一用不染色的对照组就行了。
（3） 请点击Apply to Group按钮，选中对应的数据组，简单模式的你的补偿就已经OK了~
3、画十字门
最后呢我们来唠一下关于结果怎么看的那些事儿~
我们通过十字门，将细胞分为了四个象限（见图4），分别对应了四种不同的染色情况，左下象限是两个染料都没染到的健康细胞，右下是染上了Annexin V-FITC，没染上PI的早期凋亡细胞，右上象限我们一般情况下把它判定为晚期凋亡细胞（FITC和PI都能染上），但实际情况中，右上象限也是包括了一部分坏死细胞的，但是比例比较小，一般是忽略掉的。左上象限是坏死细胞（不经凋亡，因此没有PS外翻，但是细胞坏死后细胞膜损坏，因此核酸染料可以进入）。
讲完了结果的四个象限划分，我们回到四个象限本身，这个十字门该怎么画呢？
这边小V给到大家一个最优的画法~大家可以掏出你调节好补偿的数据，找出两个单染组，然后根据单染组的分群大致画出横纵坐标轴的荧光强度分界，然后在双染的数据中以这两个分界为基准，结合数据的实际分群情况进行微调，就是属于你数据的十字门了~这边也是强调一下，需要一起分析的数据们，都必须用统一的十字门哟！
最后，有几个点需要补充说明一下，也是大家经常遇到的一些问题：
1. 我的细胞贴壁非常的厉害，不含EDTA胰酶我都得消化个15、20分钟，怎么办？
遇到这种情况，小V建议你两害相权取其轻，Binding Buffer里最重要的组分是钙离子，建议大家用不含EDTA的胰酶是因为EDTA螯合剂会把钙离子扯下来，降低Annexin V的标记效率。但是如果消化要花费15分钟甚至更久，会引入很多机械性损伤，对于数据分析有很大的影响。所以这种时候用含EDTA的胰酶也是可以的，但是后续一定要洗涤干净。
2. 我能不能延长染色时间啊？我觉得10分钟染色，好像染得不够多啊？
不可以的哦，10分钟是最优化的染色时间，染色时间过长的情况下会产生假阳性，不利于真实的实验结果分析。
3. 我的细胞因为种种原因，就是没办法好好分群，我该怎么画门呢？
这里首先要同情一下这位同学，然后要告诉大家，遇到这种情况，可做一个健康细胞双染（同一份健康细胞，加染料与不加染料，其本底荧光值会有偏移，因此这边必须进行双染），健康细胞肯定是染不上染料的，那么你就得到了一团在左下角的细胞，以一团细胞的边界为标准画十字门，然后统一用这个十字门就可以了。
4. 我这边没有流式，我该在哪里停止实验啊？
收集好细胞后，经PBS洗涤并用Binding Buffer重悬，放置在冰上去平台处染色然后上机即可。中间时间不宜过长，否则细胞状态容易变差。
友情提醒：如果细胞本身凋亡就非常多，那么转移过程可能导致细胞状态急速变差。因此需要根据细胞本身特性和药物处理后细胞状态进行综合判断，建议针对不同实验条件开展优化。
好啦~今天的课小V就讲到这里了，如果大家在实验方面有任何疑问， 欢迎随时咨询小V，或直接联系您身边的诺唯赞人，我们将努力为您提供更优质的产品和服务！最后，祝福大家实验顺当结果好，细胞超乖不作妖！
#TFBOYS[超话]#身为一个微博小白和无组织的团粉，我真的深刻意识到草妹的苦了，任何时候我们都没有话语权，因为我们心里有三家，什么时候我们都没有资格为某一家说话。凯家受委屈，我们维护凯家就是源唯千唯，源家受委屈，我们就是凯唯千唯，千家受委屈，我们就是凯唯源唯。太难了！喜欢一个人就够苦了，我们还喜欢三个。
草妹们加油。为自己没有放弃鼓掌！
草妹们加油。为自己没有放弃鼓掌！
✋热门推荐