#在 µ-Slide 球体灌注载玻片中的L929 球体进行 FDA/PI 活/死染色#
本应用是在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中对球体进行荧光染色的示例。
我们使用荧光素二乙酸酯 (FDA) 和碘化丙啶 (PI)，这是用于分别区分活细胞和死细胞的标准染色。FDA 被活细胞吸收，将非荧光 FDA 转化为绿色荧光代谢物荧光素。测量的信号用作活细胞的指标，因为转化是酯酶依赖性的。相比之下，细胞核染色染料 PI 不能通过活细胞的细胞膜。只有在死细胞中，它通过无序的细胞膜区域到达细胞核，并插入细胞的 DNA 双螺旋。
同时使用这两种荧光染料可以轻松区分 3D 球体中的活细胞和死细胞群。
重要提示：与标准方案相比，使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 进行染色需要更多的孵育时间和更多的洗涤步骤。这是为了确保染料和抗体充分扩散到利基区域。
相关文件：
在球体灌注载玻片中生成L929球体并进行动态培养实验
关键词：
· 荧光显微镜、活细胞成像、活/死细胞染色、二乙酸荧光素 (FDA)、碘化丙啶 (PI)
材料：
· μ-Slide Spheroid Perfusion Bioinert (80350, ibidi, Germany) 用于 L929 球体制备，见上面相关文件内容详情
· PI（CN74.2， Carl Roth）
· FDA (F7378, Sigma Aldrich)
· 细胞培养基（21875034，RPMI-1640，Gibco）
· 带有合适滤光片组的荧光显微镜
1. 染色
· 在无血清细胞培养基中制备染色溶液，以获得 PI 的最终浓度：200 µg/ml 和 FDA：80 µg/ml。
· 根据说明进行培养基更换并填充染色溶液。
· 在 37°C 和 5% CO2下孵育 30 分钟。
· 进行培养基交换并填充细胞培养基。此洗涤步骤将去除染色溶液。洗三遍。在每个洗涤步骤之间等待 10 分钟。
2. 成像
· 用合适的滤片组在荧光显微镜下观察细胞。
· 或者，叠加图像以创建合并图像。
3. 结果（如图）
使用 ibidi 泵系统以 0.75 毫升/分钟灌注培养 14 天后，在 µ-Slide 球体灌注中用FDA/PI对 L929 球体进行活/死染色，Bioinert。绿色：活细胞（二乙酸荧光素，FDA）；红色：死细胞（碘化丙啶，PI）。宽场荧光显微镜，10x 物镜。
本应用是在 µ-Slide Spheroid Perfusion 中对球体进行荧光染色的示例。
我们使用荧光素二乙酸酯 (FDA) 和碘化丙啶 (PI)，这是用于分别区分活细胞和死细胞的标准染色。FDA 被活细胞吸收，将非荧光 FDA 转化为绿色荧光代谢物荧光素。测量的信号用作活细胞的指标，因为转化是酯酶依赖性的。相比之下，细胞核染色染料 PI 不能通过活细胞的细胞膜。只有在死细胞中，它通过无序的细胞膜区域到达细胞核，并插入细胞的 DNA 双螺旋。
同时使用这两种荧光染料可以轻松区分 3D 球体中的活细胞和死细胞群。
重要提示：与标准方案相比，使用 µ-Slide Spheroid Perfusion 进行染色需要更多的孵育时间和更多的洗涤步骤。这是为了确保染料和抗体充分扩散到利基区域。
相关文件：
在球体灌注载玻片中生成L929球体并进行动态培养实验
关键词：
· 荧光显微镜、活细胞成像、活/死细胞染色、二乙酸荧光素 (FDA)、碘化丙啶 (PI)
材料：
· μ-Slide Spheroid Perfusion Bioinert (80350, ibidi, Germany) 用于 L929 球体制备，见上面相关文件内容详情
· PI（CN74.2， Carl Roth）
· FDA (F7378, Sigma Aldrich)
· 细胞培养基（21875034，RPMI-1640，Gibco）
· 带有合适滤光片组的荧光显微镜
1. 染色
· 在无血清细胞培养基中制备染色溶液，以获得 PI 的最终浓度：200 µg/ml 和 FDA：80 µg/ml。
· 根据说明进行培养基更换并填充染色溶液。
· 在 37°C 和 5% CO2下孵育 30 分钟。
· 进行培养基交换并填充细胞培养基。此洗涤步骤将去除染色溶液。洗三遍。在每个洗涤步骤之间等待 10 分钟。
2. 成像
· 用合适的滤片组在荧光显微镜下观察细胞。
· 或者，叠加图像以创建合并图像。
3. 结果（如图）
使用 ibidi 泵系统以 0.75 毫升/分钟灌注培养 14 天后，在 µ-Slide 球体灌注中用FDA/PI对 L929 球体进行活/死染色，Bioinert。绿色：活细胞（二乙酸荧光素，FDA）；红色：死细胞（碘化丙啶，PI）。宽场荧光显微镜，10x 物镜。
#使用 FDA 和 PI 进行活细胞和死细胞染色#
1.信息：
基于荧光的活-死检测可用于评估哺乳动物细胞的活力。同时使用两种荧光染料可以用两种颜色区分活细胞群体和死细胞群体。在本应用简报中，我们介绍了使用荧光素二乙酸酯 (FDA) 和碘化丙啶 (PI) 的染色方案，它们分别对活细胞和死细胞进行染色。染色方案适用于贴壁细胞、嵌入细胞外基质中的单细胞和 3D 细胞簇，例如多细胞球体。
2.原理：
活/死染色可以使用 FDA 和 PI 进行。FDA 被细胞吸收，这些细胞将非荧光 FDA 转化为绿色荧光代谢物荧光素。测量的信号用作活细胞的指标，因为转化依赖于酯酶。相比之下，细胞核染色染料 PI 不能通过活细胞膜。它通过死细胞膜的无序区域到达细胞核，并插入细胞的 DNA 双螺旋。
3.材料:
对于该方案，以下材料和设备是必要的：
· 荧光素二乙酸酯（例如：Sigma-Aldrich Co. LLC, C-7521））
o FDA 储备液是通过将 5 mg FDA 溶解在 1 ml 丙酮中制备的（储备液储存于 -20 °C）
· 碘化丙啶（例如：Sigma-Aldrich Co. LLC, P4170）
o PI 储备液是通过将 2 mg PI 溶解在 1 ml PBS 中制备的（储备液储存在 4 °C）
· 不含 FCS 的细胞培养基
· PBS 或替代缓冲液
· 倒置荧光显微镜，带滤光片组，适用于 Texas Red 和 FITC
4.染色方案
染色溶液应始终新鲜配制，使用时间不得超过 2 小时。避光保存，不需要时将其置于 4°C。
表1 FDA/PI染色溶液
成分
体积
不含 FCS 的培养基
5毫升
FDA (5 毫克/毫升)
8 µl
PI（2 毫克/毫升）
50µl
4.1 单细胞染色方案
贴壁细胞以及嵌入细胞外基质中的单个细胞可以使用以下方案进行染色：
1. 根据表1制备染色溶液（保存在冰箱中）。
2. 去除细胞培养基。
3. 添加染色溶液。体积取决于所用载玻片或培养皿的几何形状（请参阅相应的产品说明）。
4. 在室温下避光孵育细胞 4 到 5 分钟。
5. 去除染色溶液。
6. 用 PBS 清洗样品。
7. 向样品中添加 PBS 或不含 FCS 的培养基。
8. 用荧光显微镜分析样品。
4.2 3D 细胞培养的染色方案
以下方案可用于 3D 细胞培养，例如多细胞球体或小组织样本。
1. 根据表1制备染色溶液（保存在冰箱中）。
2. 细胞簇的集合。如有必要，增加离心步骤。
3. 去除上清液。
4. 添加 1 ml 染色溶液。
5. 将样品在室温下避光孵育 4 到 5 分钟。
6. 去除染色溶液。
7. 用 PBS 清洗样品。
8. 向样品中添加 PBS 或不含 FCS 的培养基。
9. 将细胞簇转移到 µ-Slide 8 孔中 (ibidi, 80826)。
10. 用荧光显微镜分析样品。
5.故障排除
· 信号微弱
可能必须根据您的条件采用染料浓度或孵育时间。此外，请确保使用染色溶液的时间不要超过两个小时。将染色溶液在 4°C 下避光保存。
· 高背景信号
培养基成分可能会干扰荧光信号。确保使用无血清培养基。其他替代方案可能是使用无酚红培养基或 PBS。去除染色溶液后的额外洗涤步骤也可以降低背景信号。
· 荧光信号的时间依赖性
随着时间的推移，漂白效果正在发生。因此，快速工作对于确保可重现的条件至关重要。在处理大量样品时，建议一次只对有限数量的样品进行染色。建议使用载物台培养箱以确保细胞的最佳生长条件。
6.例子
6.1 单细胞的示例图片
图 1 贴壁细胞系 MDA-MB-231 的活力染色显示高细胞活力（从左到右：相差图像、PI 信号、FDA 信号、FDA 和 PI 信号的合成）。 （比例尺：200 µm）
图 2 嵌入胶原凝胶中的 Jurkat 细胞的活力染色显示细胞活力为 65%。 （A：相衬图像；B：PI 信号；C：FDA 信号；D：FDA 和 PI 信号的合成）（比例尺：200 µm）
6.2 球体的示例图片
图 3 MCF-7 球体的活力染色（从左到右：相差图像、PI 信号、FDA 信号、FDA 和 PI 信号的合成）。（比例尺：200 µm）
图 4 MCF-7 球体的共聚焦激光扫描显微镜图像揭示了球体的内部结构：坏死中心被一层活细胞包围（从左到右：PI 信号、FDA 信号、FDA 和PI 信号）。 （比例尺：200 µm）
1.信息：
基于荧光的活-死检测可用于评估哺乳动物细胞的活力。同时使用两种荧光染料可以用两种颜色区分活细胞群体和死细胞群体。在本应用简报中，我们介绍了使用荧光素二乙酸酯 (FDA) 和碘化丙啶 (PI) 的染色方案，它们分别对活细胞和死细胞进行染色。染色方案适用于贴壁细胞、嵌入细胞外基质中的单细胞和 3D 细胞簇，例如多细胞球体。
2.原理：
活/死染色可以使用 FDA 和 PI 进行。FDA 被细胞吸收，这些细胞将非荧光 FDA 转化为绿色荧光代谢物荧光素。测量的信号用作活细胞的指标，因为转化依赖于酯酶。相比之下，细胞核染色染料 PI 不能通过活细胞膜。它通过死细胞膜的无序区域到达细胞核，并插入细胞的 DNA 双螺旋。
3.材料:
对于该方案，以下材料和设备是必要的：
· 荧光素二乙酸酯（例如：Sigma-Aldrich Co. LLC, C-7521））
o FDA 储备液是通过将 5 mg FDA 溶解在 1 ml 丙酮中制备的（储备液储存于 -20 °C）
· 碘化丙啶（例如：Sigma-Aldrich Co. LLC, P4170）
o PI 储备液是通过将 2 mg PI 溶解在 1 ml PBS 中制备的（储备液储存在 4 °C）
· 不含 FCS 的细胞培养基
· PBS 或替代缓冲液
· 倒置荧光显微镜，带滤光片组，适用于 Texas Red 和 FITC
4.染色方案
染色溶液应始终新鲜配制，使用时间不得超过 2 小时。避光保存，不需要时将其置于 4°C。
表1 FDA/PI染色溶液
成分
体积
不含 FCS 的培养基
5毫升
FDA (5 毫克/毫升)
8 µl
PI（2 毫克/毫升）
50µl
4.1 单细胞染色方案
贴壁细胞以及嵌入细胞外基质中的单个细胞可以使用以下方案进行染色：
1. 根据表1制备染色溶液（保存在冰箱中）。
2. 去除细胞培养基。
3. 添加染色溶液。体积取决于所用载玻片或培养皿的几何形状（请参阅相应的产品说明）。
4. 在室温下避光孵育细胞 4 到 5 分钟。
5. 去除染色溶液。
6. 用 PBS 清洗样品。
7. 向样品中添加 PBS 或不含 FCS 的培养基。
8. 用荧光显微镜分析样品。
4.2 3D 细胞培养的染色方案
以下方案可用于 3D 细胞培养，例如多细胞球体或小组织样本。
1. 根据表1制备染色溶液（保存在冰箱中）。
2. 细胞簇的集合。如有必要，增加离心步骤。
3. 去除上清液。
4. 添加 1 ml 染色溶液。
5. 将样品在室温下避光孵育 4 到 5 分钟。
6. 去除染色溶液。
7. 用 PBS 清洗样品。
8. 向样品中添加 PBS 或不含 FCS 的培养基。
9. 将细胞簇转移到 µ-Slide 8 孔中 (ibidi, 80826)。
10. 用荧光显微镜分析样品。
5.故障排除
· 信号微弱
可能必须根据您的条件采用染料浓度或孵育时间。此外，请确保使用染色溶液的时间不要超过两个小时。将染色溶液在 4°C 下避光保存。
· 高背景信号
培养基成分可能会干扰荧光信号。确保使用无血清培养基。其他替代方案可能是使用无酚红培养基或 PBS。去除染色溶液后的额外洗涤步骤也可以降低背景信号。
· 荧光信号的时间依赖性
随着时间的推移，漂白效果正在发生。因此，快速工作对于确保可重现的条件至关重要。在处理大量样品时，建议一次只对有限数量的样品进行染色。建议使用载物台培养箱以确保细胞的最佳生长条件。
6.例子
6.1 单细胞的示例图片
图 1 贴壁细胞系 MDA-MB-231 的活力染色显示高细胞活力（从左到右：相差图像、PI 信号、FDA 信号、FDA 和 PI 信号的合成）。 （比例尺：200 µm）
图 2 嵌入胶原凝胶中的 Jurkat 细胞的活力染色显示细胞活力为 65%。 （A：相衬图像；B：PI 信号；C：FDA 信号；D：FDA 和 PI 信号的合成）（比例尺：200 µm）
6.2 球体的示例图片
图 3 MCF-7 球体的活力染色（从左到右：相差图像、PI 信号、FDA 信号、FDA 和 PI 信号的合成）。（比例尺：200 µm）
图 4 MCF-7 球体的共聚焦激光扫描显微镜图像揭示了球体的内部结构：坏死中心被一层活细胞包围（从左到右：PI 信号、FDA 信号、FDA 和PI 信号）。 （比例尺：200 µm）
35 mm培养皿免疫荧光染色成像应用
ibidi特色培养皿
1.标准高壁有更大的容积，用于标准应用；
2.低壁有更广的操作角度，利于显微操作；
3.独特的ibidi 标准底部：完美的细胞培养环境；也可选择玻璃底培养皿，应用于激光共聚焦、TIRF(全内荧光反射技术)、DIC和单分子应用；
4.出色的成像效果；
5.ibitreat处理表面为细胞提供良好的生长环境；
6.盖子的锁扣设计能有效防止蒸发；
7.使用特殊DIC盖子可以用于DIC。
产品应用：
1.细胞培养和高分辨率荧光显微镜
2.免疫荧光染色
3.活细胞成像
4.转染
5.使用特殊的DIC盖子可以用于DIC
6.荧光相关光谱
7.可用于confocol，TIRF，DIC和单细胞应用
技术特点：
1.标准的35mm直径
2.生物相容性塑料材质，不使用粘合剂，因此不会对细胞造成伤害
3.打开方便
4.没有自发荧光
5.和所有的染色和固定溶剂相容
6.玻璃底的，由D 263 M 肖特玻璃制成，厚度为170 µm +/- 10 µm
带有锁扣功能的盖子，可最大程度地减少蒸发
所有ibidi µ-Dishes均配有特殊的盖锁功能。锁定位置最大程度地减少了蒸发，从而为非潮湿环境下的长期研究提供了极好的条件。由于培养皿的透气性塑料，可以在细胞培养过程中保持气体交换（二氧化碳或氧气）。
应用效果展示：
图片
牛内皮细胞的三重免疫荧光。
红色：线粒体，用MitoTracker™红色CMXRos染色；
绿色：F-肌动蛋白，用Alexa Fluor™488 Phalloidin染色；
蓝色：核，用DAPI染色。
聚合物底部vs玻璃底
图片
ibidi特色培养皿
1.标准高壁有更大的容积，用于标准应用；
2.低壁有更广的操作角度，利于显微操作；
3.独特的ibidi 标准底部：完美的细胞培养环境；也可选择玻璃底培养皿，应用于激光共聚焦、TIRF(全内荧光反射技术)、DIC和单分子应用；
4.出色的成像效果；
5.ibitreat处理表面为细胞提供良好的生长环境；
6.盖子的锁扣设计能有效防止蒸发；
7.使用特殊DIC盖子可以用于DIC。
产品应用：
1.细胞培养和高分辨率荧光显微镜
2.免疫荧光染色
3.活细胞成像
4.转染
5.使用特殊的DIC盖子可以用于DIC
6.荧光相关光谱
7.可用于confocol，TIRF，DIC和单细胞应用
技术特点：
1.标准的35mm直径
2.生物相容性塑料材质，不使用粘合剂，因此不会对细胞造成伤害
3.打开方便
4.没有自发荧光
5.和所有的染色和固定溶剂相容
6.玻璃底的，由D 263 M 肖特玻璃制成，厚度为170 µm +/- 10 µm
带有锁扣功能的盖子，可最大程度地减少蒸发
所有ibidi µ-Dishes均配有特殊的盖锁功能。锁定位置最大程度地减少了蒸发，从而为非潮湿环境下的长期研究提供了极好的条件。由于培养皿的透气性塑料，可以在细胞培养过程中保持气体交换（二氧化碳或氧气）。
应用效果展示：
图片
牛内皮细胞的三重免疫荧光。
红色：线粒体，用MitoTracker™红色CMXRos染色；
绿色：F-肌动蛋白，用Alexa Fluor™488 Phalloidin染色；
蓝色：核，用DAPI染色。
聚合物底部vs玻璃底
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