SSR分子标记实验操作及其注意事项
#生物试剂#
SSR(Simple Sequence Repeats ) 又称微卫星DNA，是一类由几个(多为1~6个) 碱基组成的基序(motif )串联重复而成的DNA序列，其长度一般较短，它们广泛分布于整个基因组的不同位置上，每个座位上重复单位的数目及重复单位的序列都可能不完全相同，因而造成了每个座位上的多态性。SSR标记数量丰富，覆盖整个基因组，而且分布均匀，多态性高，呈共显性遗传，重复性好，操作简便，是一种理想的分子标记技术，被广泛应用于构建基因连锁图分子辅助育种品种鉴定遗传资源的保存等方面。
一、试剂配制
1.0.2%亲水binding silence（现配现用）：1500μL95%乙醇，7.5μL冰醋酸，再加入3μLbinding silence，混匀后使用。
2.0.5%疏水repel silence（购买后可直接使用）
3.TBE母液（5×TBE）：Tris Base,54g;硼酸,7.5g;EDTA(0.5M pH8.0),20ml.搅拌溶化，定容至1000ml，无需灭菌，室温保存，母液的pH值应保持在8.3左右。
4.Urea－TBE(一块胶板用量)： 5×TBE,12ml;尿素,27g.加双蒸水溶解后定容至51ml，使用漏斗过滤。
5.40％丙烯酰胺：丙烯酰胺,380g;甲叉双丙烯酰胺,20g.加热至37℃使之溶解，加水定容至1000ml，用醋酸纤维素滤膜（入Nalge滤器，0.45μm孔径）过滤，棕色瓶避光保存于室温。
6.10％APS（过硫酸铵）：超纯过硫酸铵,2g;超纯水,18ml.溶解后，4℃保存。
7.TEMED（购买后可直接使用）：电泳级的TEMED可购自Bio-Rad，Sigma或其他供应商。
8.Loading buffer：去离子甲酰胺,50ml;0.5MEDTA(pH8.0),1ml;二甲苯腈蓝cyanol,0.125g;溴酚蓝,0.125g.混匀后置于4℃保存。
9.固定液：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸的固定液。
10.染色溶液(ACS 试剂)：无水乙醇50ml，冰醋酸2.5ml，水447.5ml，AgNO3 1g。配制成终浓度为10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3的染色液。
11.显影溶液：15g NaOH，0.5ml 甲醛，水500ml。终浓度为3％NaOH，0.1%甲醛。
二：DNA提取过程中的注意事项
(1) 避免试验材料间DNA的交叉污染或外来DNA的污染。使用冷冻干燥叶片法，可以将每个样品在单独的离心管中研磨，研磨使用的小钢珠球最好是一次性的，如果是反复使用的小钢珠球，必须彻底清洗干净使用液氮和研钵研磨叶片组织时，必须在每次研磨前彻底清理干净研钵和研磨棒。
(2) 试验材料应选取幼嫩组织，因为植物幼嫩组织DNA含量高，且多糖多酚含量少。
(3) 装入离心管的叶片组织最好不要超过离心管的1/3-1/2，否则会引起细胞裂解不完全，导致产量和纯度下降。
(4) 使用液氮研磨时，要先将研钵用液氮冷却，在加入液氮后，要先将叶片压碎，研磨时要快速用力，尽量使样品磨成粉末状。
(5) 水浴前需要确保试管盖盖严，或使用辅助工具进行加固，以防止水浴时因温度较高导致试管盖开裂。
(6) 水浴过程中，每隔10-15min将离心管取出振荡摇匀，使粉碎的叶片组织尽量与裂解液充分接触，破坏细胞结构，释放DNA。
(7) 实验过程中振荡动作不宜剧烈，移液枪头最好使用大孔枪头，移液动作不能太快，以免使DNA断裂。
(8) 当DNA以小球状固体沉积在离心管底部后，倾倒离心管中多余液体时，应避免把DNA小球一起倒出 可在倒去大部分液体后，改用吸水纸吸取剩余液体。
(9) DNA风干最好在无菌操作台上进行，待乙醇彻底风干后才能加入TE或ddH2O溶解，如果有残留的乙醇，可能会影响PCR反应的试验结果。
(10) 如果DNA纯度不好，可将粗提物用溶液1×TE充分溶解，离心后，取上清液再次沉淀DNA，可有效除去多糖。
三：实验步骤
1、玻璃板清洗：
1）用洗涤剂把玻璃反复擦洗干净，用酒精擦干、干燥。在疏水玻璃板上均匀涂上300-500μL的0.5%的疏水剂Binding Silane。可放置过夜。
2）配制凝胶前，在亲水玻璃板上均匀涂上2％的亲水剂Repel Silane，保证玻璃板的每个地方都涂上亲水剂，晾干至少5min，然后用酒精轻轻擦拭以去掉多余的亲水剂。
3）玻璃板彻底干燥后进行玻璃板组装。两块玻璃板两边边缘割伤配套的硬纸条，橡皮夹子夹住两边，在橡皮夹子里加上硬纸片可以保证玻璃板的水平，可以有效地防止条带跑歪。下边套上有旋钮的塑料套，旋紧旋钮，以防止底下漏胶在插入梳子的位置插入一个硬纸条以保证上方凝胶界面水平且整齐。
4）将装好的玻璃板水平放置于桌面上，亲水玻璃板至于下面，而带电极的疏水玻璃板朝上，保证玻璃板的水平。
2、聚丙烯酰胺凝胶的制备
1）每一块胶的用量配制如下：（大胶）
Urea－TBE

51ml
40%丙烯酰胺

9ml
10%APS

400μl
TEMED

30μl
共计

约60ml
2）迅速轻轻摇匀，注意不要用力搅拌，混匀后立即灌胶。
3）将混合液导入大注射器中，将导管中气泡挤出，迅速将导管口插入灌胶口，在重力作用下，混合液流入两块玻璃板之间，人为控制流速以防止气泡产生。
4）灌胶完成后，聚合时间至少在1小时，若凝胶要放置过夜，则须在凝胶两头铺上湿滤纸（以1×TBE浸湿）以防止凝胶变干。4℃保存，凝胶使用之前可保存1-2天。
3、凝胶电泳
1）正极槽（底下）中加入600ml的1×TBE缓冲液，组装上配好凝胶的玻璃板，拔去维持凝胶上方水平的硬纸条，负极槽上加入800ml的0.5×TBE缓冲液直至覆盖了凝胶上方。
2）将凝胶上方多余的胶用枪冲洗干净，并将气泡清除。
3）预电泳30min，保持在恒定功率55W（相当于电压1441V，电流38mA）。
4）预电泳完成后，关闭电源，用枪将凝胶上方多余的气泡和胶清除干净，插入梳子，再用枪将梳子中的气泡清除干净。
5）加入3μl已由loading buffer处理过的样品DNA，每块板子可点1-3个Marker，55W恒定功率电泳1.5h，至第一条Loading buffer指示带（二甲苯青带，约相当于260bp双链DNA）跑至胶板的2/3处（距底部1/3处）时停止电泳。
6）通过带电极玻璃板中部的出水孔排出0.5×TBE缓冲液，剩余的0.5×TBE缓冲液直接倒掉，缓冲液可反复使用几次。
7）小心的分开两块玻璃板，这时凝胶会粘连在涂有亲水剂的玻璃板上。
4、银染
1）将带凝胶的玻璃板浸在固定液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸）中20min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方。
2）将玻璃板取出，浸在染色液（10％ 乙醇，0.5% 冰醋酸，0.2% AgNO3 (ACS 试剂)）中15min，凝胶朝下放置，玻璃板位于上方。
3）用自来水（最好用双蒸水）短时间（5-10s）冲洗玻璃板两面，玻璃板须离水近些，否则凝胶容易变黑。
4）将凝胶浸在显影液（3％NaOH，0.1%甲醛）中，显影20-30min，直至带纹出现。凝胶朝上放置。
5）用自来水（最好用双蒸水）冲洗凝胶两遍，每次2min。
6）室温下自然干燥，干燥后的胶板覆盖保鲜膜，可以永久保存，也可以进行拍照记录。
四、PCR反应
1、模板及引物配制
1）模板DNA：使用25ng/μl的DNA作为模板。
2）引物：母液250M，取10μl的母液加水至100μl即得到25μM的引物。
2、DNA片段扩增：
取2uL烯释的模板DNA(25ng/uL)加入18uL如下的反应液：
H2O

13.5
10×buffer

2
dNTPs(10mM)

0.4
引物Ⅰ(25uM)

0.4
引物Ⅱ(25uM)

0.4
MgCL2(1.5mM)

1.2
Taq酶(5U/uL)

0.1
Total

18
混合后按如下PCR程序扩增：
Step1

95℃

9M；
Step2

94℃

50S；
Step3

退火温度

45S；
Step4

72℃

90S；
Srep5 Go to Step2，repeat 27 cycles；
Step6

72℃

7M。
扩增后的样品中加入3/4体积的Loading Buffer，混合，95℃变性，待用。
五：PCR 反应实验操作注意事项
PCR 反应过程中应特别注意不要使样品相互污染， 以免造成试验结果不准确， 同时也要注意所加试剂或样品必须是经过混匀后的液体， 这样才能保证反应液各成分的浓度和体积的均一性 所用试剂需从正规商家购进， 以保证试剂的质量。
( 1) 尽量使用一次性手套 专用整套移液器 成套试剂和其他必需品， 避免外来 DNA 污染反应体系( 2) DNA 模板应稀释为适宜的浓度， 使加入 PCR反应的 DNA 样品体积最好在 4 ～ 5 l 如果 DNA 模板样品量太少， 仅有1 ～ 2 l， 不仅实验操作难度大， 而且如果操作时间长， 会导致 DNA 反应液部分或全部蒸发掉， 影响 PCR 反应结果。
( 3) 可以先将 DNA 样品加到 PCR 管底部， 再加其他 PCR 反应混合液 加样时选择不同的方位加 DNA模板和其他 PCR 反应混合液， 这样枪头靠壁加样时不会交叉污染。
( 4) 加样完毕后， 盖上盖子， 混匀反应液， 再低速离心片刻( 1 min 左右) 如果不是立即进行 PCR 扩增， 需将 PCR 反应混合液置于 － 20 ℃保存备用。
( 5) PCR 扩增反应使用的酶不能长时间放置于室温下， 须随用随取， 使用完毕后立即放回 － 20 ℃冰箱否则， 酶易失活。
( 6) PCR 反应的退火温度应根据不同的引物来确定最佳退火温度， 以确保扩增的条带中杂带少， 目标带明显， 引物退火温度一般按照 Tm = 4 ℃( G + C) + 2 ℃( A + T) 公式计算。

【融化在春风里...“尔滨”开拆冰雪景观，全是技术活】花式浪漫的冰雪童话、热情周到的待客之道，哈尔滨在这个冬天彻底火出圈，成为旅游城市中的顶流。近日，哈尔滨冰雪大世界、松花江冰雪嘉年华等景区陆续发布公告称，因气象条件（包括天气回暖和大风）等原因，相关冰雪景区或闭园，或暂停开放，部分出现融化迹象的冰雪景观正在拆除。在抖音等短视频社交平台，哈尔滨景区部分冰雕作品被铲车拆除的画面，引发众多网友关注与热议。

“冰雪大世界即将融化在春风里”“冰雪艺术从来都是消逝之美”“期待在丁香盛放和下一个雪花飘舞的时节，与您再聚哈尔滨”……2月13日晚，哈尔滨冰雪大世界发布的闭园公告（2月15日24时闭园），用极具诗意的文字与粉丝们告别，这也意味着哈尔滨这个冬天的冰雪童话，即将迎来终曲。不少网友顺势提出疑问：那些遍布冰城、凝聚着无数匠人心血与智慧的冰雪景观，最终是如何谢幕的？是自然融化还是被暴力拆解？其实，拆除冰雕雪雕也是一门技术活，大有门道，一起来看看。

拆冰时间大致固定，但今年有点早

梳理近年来哈尔滨冰雪景观拆除的相关报道，时间集中在每年2月末至3月初，这与哈尔滨当地的气候条件直接相关。但相比往年，今年哈尔滨当地天气回暖较早，以致冰雪大世界、松花江冰雪嘉年华等景区闭园时间提前，拆除冰雪景观的时间也明显早一些。

据中国气象报2016年2月消息，每年的2月末至3月初，是哈尔滨人离别冰雪世界的时刻。此时，零上温度已经成为常态，闭园时间取决于冰雪消融的速度。2015年冰雪大世界是在3月2日闭园的。2016年冰雪大世界的闭园时间，也基本在这个时间段。

2022年2月27日晚，哈尔滨冰雪大世界正式闭园。同年2月28日，松花江上多个景点开始拆除冰雪建筑，以防止坍塌造成安全隐患。

2024年2月13日晚，哈尔滨冰雪大世界发布公告，宣布2月15日24时闭园，已预约游客可申请全额退款。2024第六届哈尔滨松花江冰雪嘉年华通告称，2月12日21时闭园，从13日开始有序进行撤场拆除工作，2月24日前拆除结束。2月13日起，闯关东冰雪乐园停止一切游乐项目，各商家立即有序开展游乐设施撤场工作。

有安全隐患的先拆，不是一哄而上

据哈尔滨日报，2024年2月13日，哈尔滨最高气温达到零上5度，很多游客关心“雪雕情况怎么样”。太阳岛雪博会透露，目前雪博会园区内80%以上的雪雕作品仍可观赏，完整性保持在90%以上。为保证游客安全和最佳体验，2月13日当天，部分小型雪雕将拆除，大型雪雕停止日常修复。

“气温升高后，一些小型、带有镂空等精细化雕刻的雪雕已经出现结构不稳，甚至倒塌。为了游客安全，今天将对此类雪雕进行拆除。”太阳岛雪博会工程部项目负责人范京锐称，雪雕随着气温升高，表面逐渐出现蜂窝状的风化点。目前，景区每天加紧对雪雕进行结构评估，将个别出现结构问题的雪雕围挡起来，并把结构不稳的危险部分铲掉。

2月13日当天，从开园起一直持续的雪雕“美容”工作也停止了。“大型雪雕表面形成蜂窝状风化后，表面的雪有二三十厘米处于一抓就碎的状态。”雪雕修复师李志鹏说，他的工作内容，已从修复变成了拆除。

据黑龙江政府网2016年2月19日消息，由于气温上升，哈尔滨冰雪大世界的部分冰景出现局部融化，存在安全隐患。目前，安全隐患较大的部分冰景已经拆除。据介绍，此次拆除的冰景中，有迎宾门、奥林匹亚塔、俄罗斯小塔等。同时，园方重新安全评估了所有冰景，决定封闭景观平台，拆除高度30米以上的景观顶部装饰物，清除安全隐患。其中，魅力主塔高46.5米，现已拆除了主塔的顶端装饰性冰体，同时封堵冰缝，并将主塔由顶端向下的13米塔身用金属网围合防止落冰。

冰雕挖“墙脚”，雪雕刮“冰激凌”

据中国气象报，拆除冰雪景观和建筑，是一个马虎不得的“精细活”，保证安全是重中之重。哈尔滨冰雪大世界的整个拆除过程，要历时20天左右，每处冰景的拆除都要进行严格的计算。

比如，高大的冰雕需要先用钩机（挖掘机）破拆，一个大型的冰景，在预测好位置和滚落方向后，使用钩机的铁手臂，先拆除冰景的下半部分。随着下半部分被掏空，伴随的“咔咔”碎裂声，一个巨大的冰景就轰然倒地了。而拆除雪雕，则需要用大型机械一层层将雪刮掉，过程好像用巨型冰铲刮取冰激凌。

据吉林网，2017年2月，长春南湖公园决定对公园内50多座雪雕进行拆除。“由于每座雪雕都是形态各异，且规模都不一样，拆除的手法也不是全都相同。”工作人员介绍，为避免拆除过程中对地面造成损坏，他们拆除前还在施工区域铺上了厚厚的白雪，以减少对地面的摩擦。据介绍，越大型的雪雕拆除起来越困难，需要用钩机，一点一点地拆除。

迷你挖机上雪坡，先拆灯线后冰雪

据中国新闻周刊，官方信息称，冰雪大世界宣布停止营业后，即开始处理各式各样的冰景建筑，主要是利用人工和机器（铲车推土机）推倒、破坏大型冰建（冰建筑物）冰雕。在拆除时，遵循“先拆灯后拆冰”的原则。

据黑龙江广电都市频道，2022年2月28日，松花江上多个景点开始拆除冰雪建筑。令人印象最深刻的就是惊险刺激的大滑梯。为避免大滑梯的雪坡因温度升高坍塌，施工人员将迷你挖掘机开上大滑梯，逐步拆除雪坡。

哈尔滨冰雪嘉年华运营主管何礼介绍，先把上面这个雪墙给推掉，完了把上层的铁栅栏也拆掉。这些铁栅栏要收起来，装车拉走。记者问，（铁栅栏）不会掉到江水里吗？何礼说：“不会，我们都会实时监控，都有人看着，会按照步骤一步一步把它拆除。”

运营了一个冬天的冰雪嘉年华，冰墙雪墙里边，设置有众多的灯带和电线。运走所有娱乐设施后，工作人员需要先拆电线、灯带，然后再拆冰雪建筑。何礼说，要先把灯带和线缆刨出来，还有木棍、铁丝，要拔出来，装袋后统一用车拉走。

在哈尔滨道外区冰雪欢乐季的江面上，能看到一些杂草。哈尔滨市冰雪欢乐季工作人员张轶晨说，这边原来是个动物园。园区结束后，板房集中拆走，产生的垃圾已经打包清运走了。

或原地自然融化，或集中统一处理

拆除后的雪雕冰雕残片，又该如何处理呢？根据公开报道，处理方法也有不同。

原地自然融化。以冰雪大世界为例，运用挖掘机等机械将大型冰建冰雕碎成小块后，与小型冰建冰雕混合在一起，静等融化即可。冰化完了，再人工清理各种残余物。

放湖里或林子里。长春市南湖公园破拆后剩下的雪雕残渣，会安排排放到湖里或是拖入到林子内。

运到指定地点处理。冰雕雪塑被破拆后，铲车、吊车、翻斗车联合运用，将残冰残雪运往指定处理点，摊平，等待自然融化，再将其中的碎灯管等残余物，运到垃圾场掩埋。据长春日报2021年3月消息，长春净月潭风景区内冰雪雕陆续拆除。净月雪世界之外的冰雕雪雕拆除后，清运到净月雪世界原地铺开。净月雪世界内雪雕则原地拆除，就地铺开，待其自然融化。原地铺开的冰雪预计5月份可完全融化。

连连在北京因为心率过快再次住院了，邹城法院你们是真牛，净和原告勾结在一起合伙用假证据把连连这个无辜的小姑娘给欺负病了，我今天也去邹城看过连连父母了，连连的母亲也因为心率过快（被气的）躺床上一天了，连连的父亲今天啃了一天的大白菜叶子，我现给连连父亲下了点面条让她吃了！我也想在她父母家继续替连连照顾她生病的父母，可是原告她姐夫实在是太黑了，邹城法院又这么里外不分，有关系有钱就是娘，我实在不敢在她们家继续逗留下去了，所以现在我返回滕州了…

没有任何借款合同没有欠条，原告连连姐夫仅用假的借款明细（借款明细和诉状上的钱数相差近五万元，证据和起诉状钱数不一）剪辑合成的录音（里面的断点很明显），你邹城法院就能立案审案，帮原告连连姐夫把连连的国企工作给折腾没，还明确告诉连连只要原告提交诉状你们就立案，你们不需要查原告诉状的真假（有录音）你邹城法院真他娘的牛…，不过我想问你邹城法院的是：既然原告提交诉状你们就立案，不查原告诉状的真假，那么为什么除了连连姐夫，其他人提交诉状，你们都要看看诉状的证据够不够呐？你们不是说你们不需要查诉状的真假吗？咋别人提交诉状你们就会以证据不足驳回，不是不查吗？你们也别拿原告连连姐夫提交两次诉状你们都驳回了，第三次连连姐夫非要提交立案，你们才立的，这种话来哄人，同样的证据第一次第二次不合适咋第三次就合适了？邹城法院是原告连连姐夫开的？

不过我和连连全家也得谢谢你邹城法院，你邹城法院不立原告连连姐夫提交假证据的案子，我和连连全家以及我们所有的亲戚都还发现不了原告连连姐夫可能经过“间谍”训练这事：连连姐夫全家在她母亲家白吃白喝白住十来年却已经给连连她母亲家录了四年的录音了，因为北京那人物给连连姐夫提交的东西作了录音对比，全他妈剪辑合成的，能把四年或一个月的录音剪辑合成到几十分钟，这他妈的一一般人干不出这事来，其次平常老百姓剪辑合成个视频还可以，谁会把录音剪辑合成到一块，除非有干法律的还得是在大机关工作的人帮他一起造假一起剪辑合成录音，至于这位大机关人物是谁，我们不知道，我们等国家给我们答复…，别管他和连连最后的结果是啥样子的，以后我们这帮亲戚真得防着他了，啥时候把我们的录音剪辑合成后再让你邹城法院帮忙把我们的家产讹走，我们的子孙后代可咋办呀！

邹城法院里各位领导你们可知道就因为你们立的关于他姐夫交假证据的案子逼得连连曾经两次要轻生以证清白；你们可知道就是因为你邹城法院立这个假证据的案子…，连连母亲被气的得了脑梗（我没有瞎说，你们可以对比一下时间，你们七月十一号立案了，但却违规把连连被起诉的事瞒了连连一个多月，当时连连爸爸在淄博作康复就等连连卖了内蒙古的房子把钱拿回去给她爸爸治病，可你邹城法院却将七月二十一号下来对连连的财产进行保全的书也瞒了连连近一个月的时间，让连连错过了最佳复议期，只能眼看自己财产被封而无动于衷，连连母亲只能眼看着自己老头无钱医治被迫出院，只能眼看着自己姑娘被你邹城法院和原告联合欺负而无可奈何…，三番两次刺激下，连连的母亲得了脑梗了）…；邹城法院的各位大法官，钱和人脉真的可以你们不顾国家法律胡作非为吗？如果不是，那么请邹城法院各位大法官告诉我，你们为什么要违规立案违规操作，甚至连自己个的判决书自己个都不认呐…，10月三十一号你邹城法院自己下的判决书是：驳回原告连连姐夫的起诉，连连姐夫如果再想起诉连连姐夫得上济宁市中级人民法院起诉去，你邹城法院不会再受理此案。可是时隔一个月你邹城法院又受理此案了而且还美其名曰说立案庭和审判庭不说话。那么邹城法院各位大法官我想问你们，既然立案庭和审判庭不说话，那为什么还要单独设个审判庭，这多费人费事，以后全国法院直接只设个立案庭不就得了；邹城法院各位大法官我想问你们原告是当事人，被告就不是当事人吗？我们手里有完全的证据证明连连案子开庭时间完全凭原告一句话，原告说啥时候有时间开庭，你邹城法院就啥时候开庭，这个调解审理时间也是原告一句话，被告的话就是个屁，在连连第一个案子开庭之后，连连曾告诉法官实在不行就开二审吧！可是法官却把连连的话当成了屁，不止变着法的糊弄连连，还在连连案卷上写上当时人同意延长调解期，我想问你邹城法院一下被告人是当事人吗？被告人何时说过要延长调解期…

邹城法院的各位法官我可以明确告诉你们：万一哪天连连和她父母死了，你们就是凶手的帮凶

说实话连连和她爸爸能活到现在纯属命大#冒个泡#