ELISA步骤、试剂及注意事项
#生物试剂#
操作步骤
方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被：用 0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 1～10μg／ ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加 0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲 液洗 3 次，每次 3 分钟。(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品 0.1ml 于上述已包被之反应孔中，置 37℃孵育 1 小 时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育 0.5～1 小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度 越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测 O·D 值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm(若以 ABTS 显色，则 410nm)处，以空白对照孔调零后 测各孔 O·D 值，若大于规定的阴性对照 OD 值的 2.1 倍，即为阳性。
方法二 用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至 1～10μg／ml，每孔加 0.1ml，4℃过夜。次日洗涤 3 次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml 于上述已包被之反应孔中,置 37℃孵育 1 小时, 洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育 30-60 分钟，洗涤,最后一遍用 DDW 洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的 4、5、6。
试剂器材
1. 试剂
(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M 碳酸盐缓冲液):NaCO3?1.59 克 NaHCO3 2.93 克 加蒸馏水至 1000ml
(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2 克 Na2HPO4·12H2O 2.9 克NaCl 8.0 克 KCl 0.2 克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至 1000ml
(3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1 克 加洗涤缓冲液至 100ml 或以羊血清、兔血 清等 血清与洗涤液配成 5～10％使用。
(4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水 178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。
(5) 底物缓冲液(PH5.0 磷酸棗柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4 克／L) 25.7ml 0.1M柠檬酸(19.2 克／L) 24.3ml 加蒸馏水 50ml。
（6）TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml 无水乙醇) 0.5ml 底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl
(7) ABTS 使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl
（8）抗原、抗体和酶标记抗体。
(9) 正常人血清和阳性对照血清。
2. 器材:
(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40 孔或 96 孔，ELISA 检测仪，50μl 及 100μl 加样 器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
(3)4℃冰箱，37℃孵育箱。
注意事项
1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份， 以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或 BSA 等封闭。
2. 在 ELISA 中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是 40 孔聚苯乙烯凹孔板。 不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观 察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
（2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好, 吸附时一般要求 PH 在 9.0～9.6 之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采 用 4℃18～24 小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0 和 10μg／ml 等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的 OD 值。选择 OD 值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为 1～10μg／ml。
(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接 ELISA 法进行初步效价的滴定(见酶标记 抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗 体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反 应，而本身无色。有些供氢体(如 OPD 等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如 TMB 和 ABTS 是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以 10-30 分钟为宜。底物使 用液必须新鲜配制，尤其是 H2O2 在临用前加入。
#生物试剂#
操作步骤
方法一 用于检测未知抗原的双抗体夹心法:
1. 包被：用 0.05M PH9.牰碳酸盐包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为 1～10μg／ ml。在每个聚苯乙烯板的反应孔中加 0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲 液洗 3 次，每次 3 分钟。(简称洗涤，下同)。
2. 加样：加一定稀释的待检样品 0.1ml 于上述已包被之反应孔中，置 37℃孵育 1 小 时。然后洗涤。(同时做空白孔，阴性对照孔及阳性对照孔)。
3. 加酶标抗体：于各反应孔中，加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。37℃孵育 0.5～1 小时，洗涤。
4. 加底物液显色：于各反应孔中加入临时配制的 TMB 底物溶液 0.1ml，37℃10～30分钟。
5. 终止反应：于各反应孔中加入 2M 硫酸 0.05ml。
6. 结果判定：可于白色背景上，直接用肉眼观察结果：反应孔内颜色越深，阳性程度 越强，阴性反应为无色或极浅，依据所呈颜色的深浅，以“+”、“-”号表示。也可测 O·D 值：在 ELISA 检测仪上，于 450nm(若以 ABTS 显色，则 410nm)处，以空白对照孔调零后 测各孔 O·D 值，若大于规定的阴性对照 OD 值的 2.1 倍，即为阳性。
方法二 用于检测未知抗体的间接法：
用包被缓冲液将已知抗原稀释至 1～10μg／ml，每孔加 0.1ml，4℃过夜。次日洗涤 3 次。加一定稀释的待检样品(未知抗体)0.1ml 于上述已包被之反应孔中,置 37℃孵育 1 小时, 洗涤。(同时做空白、阴性及阳性孔对照)于反应孔中，加入新鲜稀释的酶标第二抗体(抗抗体)0.1ml，37℃孵育 30-60 分钟，洗涤,最后一遍用 DDW 洗涤。其余步骤同“双抗体夹心法”的 4、5、6。
试剂器材
1. 试剂
(1) 包被缓冲液(PH9.6 0.05M 碳酸盐缓冲液):NaCO3?1.59 克 NaHCO3 2.93 克 加蒸馏水至 1000ml
(2) 洗涤缓冲液(PH7.4 PBS)：0.15M KH2PO4 0.2 克 Na2HPO4·12H2O 2.9 克NaCl 8.0 克 KCl 0.2 克 Tween-20 0.05％ 0.5ml 加蒸馏水至 1000ml
(3) 稀释液:牛血清白蛋白(BSA) 0.1 克 加洗涤缓冲液至 100ml 或以羊血清、兔血 清等 血清与洗涤液配成 5～10％使用。
(4) 终止液(2M H2SO4）：蒸馏水 178.3ml，逐滴加入浓硫酸(98％)21.7ml。
(5) 底物缓冲液(PH5.0 磷酸棗柠檬酸):0.2M Na2HPO4(28.4 克／L) 25.7ml 0.1M柠檬酸(19.2 克／L) 24.3ml 加蒸馏水 50ml。
（6）TMB(四甲基联苯胺)使用液:TMB(10mg／5ml 无水乙醇) 0.5ml 底物缓冲液(PH5.5) 10ml0.75％H2O2 32μl
(7) ABTS 使用液:ABTS 0.5mg 底物缓冲液(PH5.5) 1ml 3％H2O2 2μl
（8）抗原、抗体和酶标记抗体。
(9) 正常人血清和阳性对照血清。
2. 器材:
(1) 聚苯乙烯塑料板(简称酶标板)40 孔或 96 孔，ELISA 检测仪，50μl 及 100μl 加样 器，塑料滴头，小毛巾，洗涤瓶。
(2) 小烧杯、玻璃棒、试管、吸管和量筒等。
(3)4℃冰箱，37℃孵育箱。
注意事项
1. 正式试验时，应分别以阳性对照与阴性对照控制试验条件，待检样品应作一式二份， 以保证实验结果的准确性。有时本底较高，说明有非特异性反应，可采用羊血清、兔血清或 BSA 等封闭。
2. 在 ELISA 中，进行各项实验条件的选择是很重要的，其中包括:
(1) 固相载体的选择：许多物质可作为固相载体，如聚氯乙烯、聚苯乙烯、聚丙酰胺和纤维素等。其形式可以是凹孔平板、试管、珠粒等。目前常用的是 40 孔聚苯乙烯凹孔板。 不管何种载体，在使用前均可进行筛选：用等量抗原包被，在同一实验条件下进行反应，观 察其显色反应是否均一性，据此判明其吸附性能是否良好。
（2) 包被抗体(或抗原)的选择：将抗体(或抗原)吸附在固相载体表面时，要求纯度要好, 吸附时一般要求 PH 在 9.0～9.6 之间。吸附温度，时间及其蛋白量也有一定影响,一般多采 用 4℃18～24 小时。蛋白质包被的最适浓度需进行滴定：即用不同的蛋白质浓度(0.1、1.0 和 10μg／ml 等)进行包被后，在其它试验条件相同时，观察阳性标本的 OD 值。选择 OD 值最大而蛋白量最少的浓度。对于多数蛋白质来说通常为 1～10μg／ml。
(3) 酶标记抗体工作浓度的选择：首先用直接 ELISA 法进行初步效价的滴定(见酶标记 抗体部份)。然后再固定其它条件或采取“方阵法”(包被物、待检样品的参考品及酶标记抗 体分别为不同的稀释度)在正式实验系统里准确地滴定其工作浓度。
(4) 酶的底物及供氢体的选择：对供氢体的选择要求是价廉、安全、有明显地显色反 应，而本身无色。有些供氢体(如 OPD 等)有潜在的致癌作用，应注意防护。有条件者应使用不致癌、灵敏度高的供氢体，如 TMB 和 ABTS 是目前较为满意的供氢体。底物作用一段时间后，应加入强酸或强碱以终止反应。通常底物作用时间，以 10-30 分钟为宜。底物使 用液必须新鲜配制，尤其是 H2O2 在临用前加入。
它从设计、到面料、到做工等每个细节都必须考究细致，使用优质羊毛/羊绒纱线纺织而成才能兼具温暖和时髦，成为百搭的利器。
设计灵感来源于浩瀚星辰，闪闪发光的金银丝线就像满天繁星，散落在温暖柔软的羊绒纱线中。由精选出细腻亲肤的皇家羊绒与奢华的金丝线和银丝线合股融合，创造出一种耀眼而微妙的光泽，简约而不简单。穿上身着时闪闪发光，为奢华的羊绒又增添了一丝高级魅力。
纺纱成衣的展现力惊人，即便是浅色系的星空羊绒布料，都能清楚地看到耀眼细闪，好像捧了一团星云，软糯细腻，顺滑亲肤。
使用了TEC可机洗工艺，套上洗衣袋就能放入洗衣机自动清洗，打理简便太省心了！在羊毛纤维表面附上一层由植物提取的超薄na米级别透明保护膜，毛衣的光泽感更强，看起来更高级，手感软糯细腻，再也不用担心羊毛羊绒衫被洗坏啦！
经典款永远是值得投资的单品，更何况是一件做工、版型、用料这么好的打底衫，买上一件就顶上普通的十件针织衫。
【现价】109 元
【拼团价】99 元
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司北柠王尘司北柠王尘-小说在线(今日热推小说全章节无弹窗)全文阅读司北柠王尘[苦涩][赞])2Na;=q6
‼请搜索公/仲/号回个主角名即可！
‼书名：《司北柠王尘》
‼主角：司北柠王尘
非小说原文：在他沉默的那一秒钟，我的心泛起了一丝丝难受。我以为他真心后悔，想和我复婚，哪怕我不接受，可是心里总有一些痛快，所以当我听到他和星彩公司合作，看到小猫落在游戏室的围巾时，那种像是被人耍了的感觉，又冒了出来。难道王尘永远学不会专一地追求一个人，爱一个人吗？不是的，上一世他在痴情这一点上表现得极好，有了蔚蓝之后，其他异性于他而言就是空气。我见过他真正爱一个人的样子，所以无法接受现在他一边纠缠我，一边对其他人有感觉的事实。就在这种磨人的沉寂中，车子来到了王尘的租房楼下。廉租房不存在物业和安保，进出自如，我下车后匆匆走进楼栋，按照记忆里王尘说过的房号开始寻找。王尘跟在我身后，一言不发。“你们干嘛啊？”在我敲了半天门没人开的时候，隔壁一个阿姨探出了头，“这个小伙子前两天就搬走了，里头没人。”我一愣，心里那股不安的感觉越来越强烈。如果王尘只是搬走了去其他城市谋生，那么绝对不会联系不上，除非他出了什么意外。 第486章“王尘，帮我找一找王尘，行吗？”我顾不上其他，首先就是找王尘帮忙。王尘却无情地拒绝了，“不行。”“他已经被蔚蓝逼到了绝路，准备离开A市了，这个关键点上突然联系不上，很可能出了事，救人一命胜造七级浮屠，你就当为自己积德！”我一把抓住了王尘的胳膊。我现在是真心把王尘当自己的弟弟一样，如果他出了什么事，我必须想办法帮一把。王尘眼中氤氲着薄怒，语气不善，“你就那么在意他？”“我和他清清白白，没有发生过任何事，但是“司北柠，你现在真有钱的话，不如先去医院挂个脑科或者精神科好吗？”我扭头就走，懒得和她废话。 “纪辛瑜，你直到现在依然不把我放在眼里是吧？”司北柠有些恼怒地拦住了我。 我视若无睹，拨开她便继续往前走。 司北柠拽我的手，我拎着的礼盒被她扯落在地上，发出一声闷响。 司北柠还想上前抓我的手，我抬手挡了一下，她竟然直接跌坐在地上，仿佛我用了极大的力气一样。 陶叶急忙去扶司北柠，然后指责我，“纪辛瑜你有病吧？你推她干什么！” 我蹲下身子把礼盒捡起来，起身时却看到王尘正站在不远处看着我。 “抱歉，我不是故意的。” 当我们的动静引来了别人的关注，司北柠一改刚才的气急败坏，反而是开口道歉。 我起身，不免有些好笑，“司北柠，你不知道这种地方四处都有监控吗？装什么无辜呢？ 一听到监控，司北柠不自然地看了一眼四周，最后视线落在了王尘身上。 王尘却只是看着我，我略有心虚。 昨天的事我都还没太敢仔细去想，本来打算这段时间疏远一点，大家都清醒一下。 没想到今天又在这里碰上了，真是有毒，干脆就假装没看到？ 我心一横，拎着礼盒转身便走，准备去找何远之，把贺礼带到以后就离开这里，毕竟同时遇到了司北柠和王尘，证明此地不宜久留。 “纪辛瑜！”王尘的声音不算高，却清晰地传入我的耳中，他三两步跟上了我的步伐，与我并肩。
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