干货分享 | Transwell侵袭实验
一、实验原理
将Transwell小室放入配套培养板中，形成由细胞可穿透性膜分隔开的两室系统，并将高营养液与低营养液分隔开，为进行侵袭实验，在膜上室铺基质胶（用由细胞外基质组成的凝胶堵塞膜中的孔，该凝胶旨在模拟肿瘤细胞在体内侵袭过程中遇到的典型基质），通过将细胞放置在凝胶的一侧，将趋化剂放置在凝胶的另一侧，侵袭细胞将降解邻近基质并迁移通过ECM凝胶（基质降解与定向运动相结合，即侵袭），从而通过计数穿过细胞以检测细胞侵袭能力。
由于Matrigel胶内含有层黏连蛋白、Ⅳ型胶原、纤连蛋白、硫酸肝素糖蛋白、触角蛋白、TGF2β及生长因子等人体ECM的大多数成分，类似动物的基底膜。因此，可模拟最真实的体内环境，体外检测细胞的侵袭性，间接反映体内肿瘤侵袭的能力。
二、实验步骤
1. 实验准备
提前12 h将Matrigel放到4℃融化，将实验用到的枪头、EP管等材料提前放到-20℃预冷；实验前准备冰盒，整个实验操作过程置于冰上进行；
2. 包被基底膜
在冰上将Matrigel胶用无血清的细胞培养基进行稀释，混匀后加入小室中，注意动作轻柔，不要产生气泡，将小室放入CO2培养箱中孵育2h备用；
3. 水化基底膜
将孵育完成的小室中上室多余的液体小心吸掉，每孔中加入100 μL无血清培养基，在培养箱中放置30 min。
4. 接种细胞
a. 将状态良好的细胞进行消化，离心，用PBS洗1-2遍，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至1-10×105/ml（需要做预实验确定具体的细胞密度）；
b. 在下室中加入500μL的含10%FBS的培养基，将小室小心放入24孔板内，在上室中加入细胞悬液100 μL-200 μL，放入培养箱中（需要做预实验确定具体的培养时间）。
5. 固定染色、拍照及计数
a. 到时间点后将小室取出，用PBS清洗小室，用棉签轻柔擦去上室细胞和Matrigel后，用4%多聚甲醛固定或甲醇20 min，将小室适当风干，用0.1%结晶紫染色30 min，PBS清洗3遍，于37℃干燥。
b. 将小室置于显微镜下，随机选取5个视野，拍照并计数。
三、注意事项
1. Matrigel使用说明
Matrigel应避免反复冻融，分装时将整瓶Matrigel埋没在碎冰盒中，再将冰盒置于4℃冰箱中，建议放在冰箱靠后的位置，放置过夜，避免使用冰箱门进行解冻，因为其内装物的温度在反复打开时会迅速上升，导致材料过早凝胶化。分装后置于-20℃保存，长期保存可放于-80℃冰箱中；
2. 如何尽量避免增殖对结果的影响
如果在侵袭实验期间发生了大量的增殖，那么计算出的绝对侵袭数据将受到影响。因此，侵袭实验时间越短，增殖对数据的影响就越小。当然，实验中的肿瘤细胞很可能在48或72小时内就会增殖，但如果每个治疗组的增殖量是相似的，允许直接比较治疗组之间的相对侵袭数据；
3. 小室的重复使用
很多实验室会将小室进行重复利用，我们需要在用棉签擦拭时避免用力，避免损伤小室膜，重复利用前应在镜下观察小室膜是否有裂缝。
4. 小室孔径的选择
#医学生##医生##动物实验外包#
一、实验原理
将Transwell小室放入配套培养板中，形成由细胞可穿透性膜分隔开的两室系统，并将高营养液与低营养液分隔开，为进行侵袭实验，在膜上室铺基质胶（用由细胞外基质组成的凝胶堵塞膜中的孔，该凝胶旨在模拟肿瘤细胞在体内侵袭过程中遇到的典型基质），通过将细胞放置在凝胶的一侧，将趋化剂放置在凝胶的另一侧，侵袭细胞将降解邻近基质并迁移通过ECM凝胶（基质降解与定向运动相结合，即侵袭），从而通过计数穿过细胞以检测细胞侵袭能力。
由于Matrigel胶内含有层黏连蛋白、Ⅳ型胶原、纤连蛋白、硫酸肝素糖蛋白、触角蛋白、TGF2β及生长因子等人体ECM的大多数成分，类似动物的基底膜。因此，可模拟最真实的体内环境，体外检测细胞的侵袭性，间接反映体内肿瘤侵袭的能力。
二、实验步骤
1. 实验准备
提前12 h将Matrigel放到4℃融化，将实验用到的枪头、EP管等材料提前放到-20℃预冷；实验前准备冰盒，整个实验操作过程置于冰上进行；
2. 包被基底膜
在冰上将Matrigel胶用无血清的细胞培养基进行稀释，混匀后加入小室中，注意动作轻柔，不要产生气泡，将小室放入CO2培养箱中孵育2h备用；
3. 水化基底膜
将孵育完成的小室中上室多余的液体小心吸掉，每孔中加入100 μL无血清培养基，在培养箱中放置30 min。
4. 接种细胞
a. 将状态良好的细胞进行消化，离心，用PBS洗1-2遍，用无血清培养基重悬细胞，调整细胞密度至1-10×105/ml（需要做预实验确定具体的细胞密度）；
b. 在下室中加入500μL的含10%FBS的培养基，将小室小心放入24孔板内，在上室中加入细胞悬液100 μL-200 μL，放入培养箱中（需要做预实验确定具体的培养时间）。
5. 固定染色、拍照及计数
a. 到时间点后将小室取出，用PBS清洗小室，用棉签轻柔擦去上室细胞和Matrigel后，用4%多聚甲醛固定或甲醇20 min，将小室适当风干，用0.1%结晶紫染色30 min，PBS清洗3遍，于37℃干燥。
b. 将小室置于显微镜下，随机选取5个视野，拍照并计数。
三、注意事项
1. Matrigel使用说明
Matrigel应避免反复冻融，分装时将整瓶Matrigel埋没在碎冰盒中，再将冰盒置于4℃冰箱中，建议放在冰箱靠后的位置，放置过夜，避免使用冰箱门进行解冻，因为其内装物的温度在反复打开时会迅速上升，导致材料过早凝胶化。分装后置于-20℃保存，长期保存可放于-80℃冰箱中；
2. 如何尽量避免增殖对结果的影响
如果在侵袭实验期间发生了大量的增殖，那么计算出的绝对侵袭数据将受到影响。因此，侵袭实验时间越短，增殖对数据的影响就越小。当然，实验中的肿瘤细胞很可能在48或72小时内就会增殖，但如果每个治疗组的增殖量是相似的，允许直接比较治疗组之间的相对侵袭数据；
3. 小室的重复使用
很多实验室会将小室进行重复利用，我们需要在用棉签擦拭时避免用力，避免损伤小室膜，重复利用前应在镜下观察小室膜是否有裂缝。
4. 小室孔径的选择
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1、所谓的人情世故，就是给别人带去利益，然后自己获得利益，这就是要想取之，必先予之的道理，所谓的人情关系也是价值交换，和高手交换，你会得到越多，和低手交换，你会失去越多。
2、你会发现很多人好面子，做什么事都会考虑自己的面子。与人交往，即使你再优秀，也别忘了给他人留点尊严。人人都渴望得到由衷的赞美，这会使人感到自身价值得到肯定。
3、不要随便发脾气，脾气发多了，不但解决不了问题，反而会伤到你自己的身体。但凡相处让你感觉很累的关系，就直接结束，你不要难为自己。
4、永远记住，位置不同，少言为贵，认知不等，不争不辩，三观不合，浪费口舌。三年学说话，一生学闭嘴。多听少说，不管闲的时候，说一些谎言，往往可以让我们的人际关系更为和谐。抱怨、诉苦这些话，不要总对着同事碎碎念，说得再多，别人也不会同情你，而面对同事的，自己心里明白就行，不要事事戳破，快嘴快舌的人反而容易得罪人。
5、经常用语言赞美别人，这样为难你的人就更少了，但同时不要被别人迷惑，话不可以说绝，甚至有时候都不能说硬话，防止别人起怀恨之心，多个敌人多道墙，多个朋友多条路。
6、管好自己的嘴，少说多听。对待很多事情，心里有底就可以了，千万不要乱讲，尤其是别人的隐私，尤其是上司的隐私，更不可以多说一句话。
7、没人喜欢被批评，在大家的内心，都不喜欢自己被人批评，语言是最伤人的，说者无心，听者有心。很多时候得罪别人，可能就那无意间说的几句话，连自己都不知道是什么原因，
8、年轻不屑于人情世故很正常，但上了年纪，碰了几次事，棱角也就被生活磨平了，这个世上没有救世主，唯一能帮你的，从来都只有自己。而你小时候幻想当超人的梦，也永远埋在心底了。
9、不要花时间，去猜别人的想法，这不重要。这么看重别人对你的看法干嘛?这个世界无论你做成什么样，都不可能让所有人对你满意，不信你看马云，他都这么成功了，对他不满的人一样很多，给时间一点时间，做最好的自己。
10、口误遮掩、喜欢抬杠、尖酸刻薄、喜欢怼人、口中无德的人，不管走到哪里，都不会受欢迎，也就只能在谁也不认识谁的互联网上宣泄一番。
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2、你会发现很多人好面子，做什么事都会考虑自己的面子。与人交往，即使你再优秀，也别忘了给他人留点尊严。人人都渴望得到由衷的赞美，这会使人感到自身价值得到肯定。
3、不要随便发脾气，脾气发多了，不但解决不了问题，反而会伤到你自己的身体。但凡相处让你感觉很累的关系，就直接结束，你不要难为自己。
4、永远记住，位置不同，少言为贵，认知不等，不争不辩，三观不合，浪费口舌。三年学说话，一生学闭嘴。多听少说，不管闲的时候，说一些谎言，往往可以让我们的人际关系更为和谐。抱怨、诉苦这些话，不要总对着同事碎碎念，说得再多，别人也不会同情你，而面对同事的，自己心里明白就行，不要事事戳破，快嘴快舌的人反而容易得罪人。
5、经常用语言赞美别人，这样为难你的人就更少了，但同时不要被别人迷惑，话不可以说绝，甚至有时候都不能说硬话，防止别人起怀恨之心，多个敌人多道墙，多个朋友多条路。
6、管好自己的嘴，少说多听。对待很多事情，心里有底就可以了，千万不要乱讲，尤其是别人的隐私，尤其是上司的隐私，更不可以多说一句话。
7、没人喜欢被批评，在大家的内心，都不喜欢自己被人批评，语言是最伤人的，说者无心，听者有心。很多时候得罪别人，可能就那无意间说的几句话，连自己都不知道是什么原因，
8、年轻不屑于人情世故很正常，但上了年纪，碰了几次事，棱角也就被生活磨平了，这个世上没有救世主，唯一能帮你的，从来都只有自己。而你小时候幻想当超人的梦，也永远埋在心底了。
9、不要花时间，去猜别人的想法，这不重要。这么看重别人对你的看法干嘛?这个世界无论你做成什么样，都不可能让所有人对你满意，不信你看马云，他都这么成功了，对他不满的人一样很多，给时间一点时间，做最好的自己。
10、口误遮掩、喜欢抬杠、尖酸刻薄、喜欢怼人、口中无德的人，不管走到哪里，都不会受欢迎，也就只能在谁也不认识谁的互联网上宣泄一番。
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