#馆行者[超话]#
蔡铣《梅寿双仙》立轴
纸本设色
长112.3厘米，52.5厘米
款识：栖息空山不計年，紅梅香暖得春先。生平縱有凌雲志，修到延齡即是仙。蔡銑畫並題。
鈴印：「蔡銑之鈢」、「震淵書畫」、「玉虫蟬砚齋」。
2023苏富比拍品
成交价¥9.4W
蔡震渊（1897～1960），名铣，字振渊、震渊。因家藏玉蝉砚，别署玉蝉砚主，榜其画室名为玉蝉砚斋。苏州人。震渊七岁读书，十二岁爱好丹青，常对物写生，一竹一石的涂染，兴味盎然。十五岁从父学医（眼科），十九岁从画家汪云奇学翎毛花卉、瓜果走兽，从李醉石学山水，从陈靖生学仕女。最初为生活计，曾在景德路开业行医，医名明远。后因感到工作单调，仍以大部分时间致力于绘画事业。最后被苏州美术专科学校校长颜文梁所赏识，遂应聘于该校任教。于此同时，又先后在苏州中学、苏州女子职业中学、振华女子小学等学校兼任国画教师，首任苏州中等校国画教师。抗战开始，避居沪上三年，以卖画为生。1941年返苏，仍操医学与绘画旧业。
建国后，他于1953年开始为上海王星记绘制扇面。1954年参加苏州细画组画檀香扇，1955年进入檀香扇生产合作社。1958年6月调至市工艺美术研究室从事设计工作，直至谢世。以工笔画著称，线条挺秀，落笔细腻，用笔得法， 设色妍艳，极具富贵气息。画猴，松鼠，其独到之笔，人称“蔡猢狲”，“蔡松鼠”，书法师恽南田。
蔡铣《梅寿双仙》立轴
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长112.3厘米，52.5厘米
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建国后，他于1953年开始为上海王星记绘制扇面。1954年参加苏州细画组画檀香扇，1955年进入檀香扇生产合作社。1958年6月调至市工艺美术研究室从事设计工作，直至谢世。以工笔画著称，线条挺秀，落笔细腻，用笔得法， 设色妍艳，极具富贵气息。画猴，松鼠，其独到之笔，人称“蔡猢狲”，“蔡松鼠”，书法师恽南田。
ChIP实验问题解答
ChIP，全称的意思是染色质免疫共沉淀——换种说法，就是我们用抗体去“钓”特定的能结合DNA的蛋白质，我们最后检测的是和这蛋白质结合的DNA。
1.为什么要用甲醛交联？
甲醛交联是 ChIP 实验非常关键的一个步骤。因为甲醛交联能更好的保存蛋白与 DNA 的相互作用，除了用于检测组蛋白修饰分布的 Native ChIP 以外，其他的 ChIP 基本上都需要用甲醛交联。
甲醛作为交联剂有几个好处：（1）甲醛是一种非常活跃的小分子，它本身可以非常容易的穿过细胞膜及核膜进入细胞核，并通过醛基将 DNA 碱基上的氨基/亚氨基与蛋白的碱性氨基酸上的氨基/亚氨基交联[1]。（2）甲醛的交联是可逆反应，可以通过加热的方式解除交联，从而方便后续的 DNA 分析。
2.甲醛交联有什么注意事项：
（1）甲醛交联用到的甲醛浓度和交联时间都是有严格要求的。一般的甲醛交联都选用 1% 的甲醛浓度，室温固定 10～15分钟。时间太短的话，交联反应进行的不彻底，很多蛋白与 DNA 的结合不是很牢固，交联时间太长的话，会导致后续超声非常困难，而增加超声时间或功率会破坏目的蛋白本身的结构，进而导致 ChIP 结果不理想。
（2）在甲醛交联之前，细胞需要尽可能少被人为处理。如果条件允许的话，直接将甲醛加入培养基或将细胞培养基吸弃并换成含有 1% 甲醛的 PBS 交联会比胰酶消化细胞以后再交联更好一些。
（3）甲醛交联反应结束之后，需要马上加入相对甲醛过量的甘氨酸（一般甘氨酸终浓度为 125 mM）与甲醛反应，终止交联反应。
（4）终止交联之后，样本需要经过 PBS 清洗（如果细胞数量比较少的话，可以在 PBS 里加入 0.1%～0.5% NP-40，这样细胞在转移时不会粘在管壁或培养皿上），细胞沉淀可以直接用液氮速冻，然后置于 -80 摄氏度长期保存。
（5）组织的交联相比细胞交联要复杂一些。虽然甲醛可以很容易的透过细胞，但是大的组织块还是不太容易交联的很均一，所以大的组织块交联之前需要切成小块。一般建议用两个刀片将组织块切成 1～3 mm3 大小。组织的交联时间一般可以延长到 15 min，这样能保证组织的充分交联。
3.染色质片段化大小有什么要求
不管是用超声还是酶切，染色质片段化大小是 ChIP 实验的一个关键点。以超声为例，打断后的 DNA 片段大小以 200～1 000bp 为宜。DNA 片段太大，一方面影响 IP 效率，更重要的是会影响 ChIP 的分辨率。DNA 片段太小虽然理论上能得到更高的分辨率，但也会影响后续的 qPCR 和建库。另外，需要注意的是，超声是通过物理的作用力将 DNA 的共价键打断，从而实现染色质片段化。其在破碎 DNA 的同时，也会在一定程度上破坏目的蛋白以及目的蛋白和 DNA 之间的相互作用。所以，超声摸索应遵循适可而止的原则。
除超声仪外，样品制备本身有三个因素会对超声效果产生影响：
（1）超声用的 buffer。这其中尤其以 SDS 的影响最大，SDS 浓度越高，DNA 越容易被打断。同时盐离子和其他去垢剂浓度都会对超声产生一定影响，一般认为盐离子或去垢剂浓度越高，DNA 越容易被打断。
（2）细胞密度。超声时的细胞密度越高，DNA 越不容易被打断。所以建议细胞密度应小于107/ml 裂解液。
（3）细胞类型。不同细胞类型间，超声效果差异也很大。相对于常用的肿瘤细胞系，很多原代培养的细胞以及组织细胞的染色质超声破碎会更困难些。
4.抗体有什么要求
超声之后的 IP 过程是 ChIP 成功与否的关键。这其中有两个因素是比较重要的：首先是抗体。ChIP 实验首先需要选用 ChIP 级的抗体[2]。
这个抗体需要满足几点要求：
(1)识别目的蛋白的立体表位。这跟做 Western Blot 的抗体是有区别的，因为 WB 的抗体识别的是蛋白的变性表位。
(2)识别甲醛交联后的立体表位。这跟做 IP 的抗体是有区别的。因为 ChIP 相对于 IP 需要甲醛交联的过程，甲醛会在 DNA 和蛋白质，以及蛋白和蛋白的氨基/亚氨基之间形成共价键，所以 ChIP 级的抗体还要识别甲醛交联后的目的蛋白。这跟免疫荧光的抗体有点类似。
(3)ChIP 级的抗体跟目的蛋白有足够强的相互作用，能够耐受高盐，低盐及多种去垢剂（比如 0.1% SDS，1% Triton X-100 或 NP-40）的清洗。所以选择抗体时，最好选择文献报道可以用于 ChIP 实验的抗体，或抗体公司提供 ChIP-qPCR 或 ChIP-seq 数据的抗体。
5.buffer有什么要求
IP 的另外一个关键因素是 buffer，这包括 binding buffer（超声用 buffer）和 wash buffer。一般来说，选用的 Buffer 越剧烈，背景 DNA 去除的就会越干净，但同样的，目的 DNA 也会被更多的清洗掉。反之，选用的 buffer 越温和，目的 DNA 得到的就会越多，但同样的，背景 DNA 也就残留的越多。对于去垢剂来说，离子型去垢剂（如 SDS，SDC）比非离子型去垢剂剧烈得多。对于盐来说，剧烈程度 LiCl ＞ NaCl ＞ KCl。去垢剂的选择，盐和去垢剂的浓度都会对 ChIP 效果产生很大影响[3]。很多实验室或公司在这方面都有自己独到的 buffer 配方。
6.可以从那些方面进行实验优化
为了降低背景，很多实验会在两个地方做优化：
(1)在超声破碎之前，首先破碎胞浆，通过离心将胞浆胞核分离，去除胞浆蛋白，降低胞浆蛋白干扰
(2)用超声后的染色质与 protein A/G beads 预孵育，在去除 beads 之后再加入鲑精 DNA 预封闭过的 protein A/G beads 和目的蛋白抗体进行孵育。
卡梅德生物（KMD Bioscience）(https://t.cn/A6W2Fk3E)拥有丰富的重组标签蛋白表达经验，能够在原核和真核表达系统为客户表达带有GST，Myc-tag，Flag-tag，HA-tag等标签的重组蛋白。利用这些标签蛋白特异性的抗体，卡梅德生物能够为客户提供ChIP共沉淀服务。
这篇文章可供科研爱好者参考。它不能代替需要更详细和专业信息的专业知识或实践实验程序。如果有任何内容侵权，请联系作者立即删除有争议的材料。
参考文献：
[1]Kumar Sunny, Basu Malini, and Ghosh Mrinal K.."Chaperone-assisted E3 ligase CHIP: A double agent in cancer." Genes & Diseases. 2022:1521-1555.
[2]石佳,朱秀梅,薛梦雨等.基于水稻原生质体的染色质免疫共沉淀技术优化及应用.生物技术通报,2022,38(07):62-69.
[3]王泓力,焦雨铃.染色质免疫共沉淀实验方法.植物学报,2020,55(04):475-480.
#卡梅德生物##染色质免疫共沉淀实验##ChIP##互作验证#
ChIP，全称的意思是染色质免疫共沉淀——换种说法，就是我们用抗体去“钓”特定的能结合DNA的蛋白质，我们最后检测的是和这蛋白质结合的DNA。
1.为什么要用甲醛交联？
甲醛交联是 ChIP 实验非常关键的一个步骤。因为甲醛交联能更好的保存蛋白与 DNA 的相互作用，除了用于检测组蛋白修饰分布的 Native ChIP 以外，其他的 ChIP 基本上都需要用甲醛交联。
甲醛作为交联剂有几个好处：（1）甲醛是一种非常活跃的小分子，它本身可以非常容易的穿过细胞膜及核膜进入细胞核，并通过醛基将 DNA 碱基上的氨基/亚氨基与蛋白的碱性氨基酸上的氨基/亚氨基交联[1]。（2）甲醛的交联是可逆反应，可以通过加热的方式解除交联，从而方便后续的 DNA 分析。
2.甲醛交联有什么注意事项：
（1）甲醛交联用到的甲醛浓度和交联时间都是有严格要求的。一般的甲醛交联都选用 1% 的甲醛浓度，室温固定 10～15分钟。时间太短的话，交联反应进行的不彻底，很多蛋白与 DNA 的结合不是很牢固，交联时间太长的话，会导致后续超声非常困难，而增加超声时间或功率会破坏目的蛋白本身的结构，进而导致 ChIP 结果不理想。
（2）在甲醛交联之前，细胞需要尽可能少被人为处理。如果条件允许的话，直接将甲醛加入培养基或将细胞培养基吸弃并换成含有 1% 甲醛的 PBS 交联会比胰酶消化细胞以后再交联更好一些。
（3）甲醛交联反应结束之后，需要马上加入相对甲醛过量的甘氨酸（一般甘氨酸终浓度为 125 mM）与甲醛反应，终止交联反应。
（4）终止交联之后，样本需要经过 PBS 清洗（如果细胞数量比较少的话，可以在 PBS 里加入 0.1%～0.5% NP-40，这样细胞在转移时不会粘在管壁或培养皿上），细胞沉淀可以直接用液氮速冻，然后置于 -80 摄氏度长期保存。
（5）组织的交联相比细胞交联要复杂一些。虽然甲醛可以很容易的透过细胞，但是大的组织块还是不太容易交联的很均一，所以大的组织块交联之前需要切成小块。一般建议用两个刀片将组织块切成 1～3 mm3 大小。组织的交联时间一般可以延长到 15 min，这样能保证组织的充分交联。
3.染色质片段化大小有什么要求
不管是用超声还是酶切，染色质片段化大小是 ChIP 实验的一个关键点。以超声为例，打断后的 DNA 片段大小以 200～1 000bp 为宜。DNA 片段太大，一方面影响 IP 效率，更重要的是会影响 ChIP 的分辨率。DNA 片段太小虽然理论上能得到更高的分辨率，但也会影响后续的 qPCR 和建库。另外，需要注意的是，超声是通过物理的作用力将 DNA 的共价键打断，从而实现染色质片段化。其在破碎 DNA 的同时，也会在一定程度上破坏目的蛋白以及目的蛋白和 DNA 之间的相互作用。所以，超声摸索应遵循适可而止的原则。
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4.抗体有什么要求
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5.buffer有什么要求
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