AFLP 原理和操作步骤
#生物试剂#
AFLP 是通过限制性内切酶片段的不同长度检测 DNA 多态性的一种 DNA 分子标记技术。 本 AFLP 技术主要特点 ：分析所需 DNA 量少，仅需 0.5g；可重复性好；多态性强；分 辨率高；不需要 Southern 杂交；样品适用性广；稳定的遗传性。在技术特点上，AFLP 实 际上是 RAPD 和 RFLP 相结合的一种产物。它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危害 和 RAPD 稳定性差，标记呈现隐性遗传的缺点，同时又兼有二者之长。近几年来，人们不 断将这一技术完善、发展，使得 AFLP 迅速成为迄今为止最有效的分子。
一、 AFLP 原理
AFLP 也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测 DNA多态性的一种 DNA分子标记技术。 但 AFLP 是通过 PCR 反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切 片段在高分辨率的顺序分 析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。实验中酶切片段首先与含有 与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末 端顺序和接头顺序就作为以后 PCR 反应的 引物结合位点。实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了 1～3 个选择性核苷的不同 引物，可以达到选择性扩增的 目的。这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异 配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。
二、实验试剂
Taq 酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI 接头、E+A 引物 M+C 引物、T4DNALigaseE 和 M 引 物、琼脂、过硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸银、甲酰胺、 dNTPs、 二甲苯青、冰醋酸、 玻璃硅烷、50bpMark
三、操作步骤
（一）基因组 DNA 提取和纯化
参考 DNA 实验方法
DNA 的纯化：用 0.8%琼脂糖凝胶（含 EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的 1/3 已提取的基因组 DNA 进行纯化，首先用 TE 缓冲液补满 至总体积 50ul，再等体积苯酚/氯 仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24∶1）各抽提一次， 离心吸上清液于 Eppendorf 管中，加入 1/10 体积的 NaAC 和二倍体积预冷的无水乙醇，－20℃放置 2h 以上，10000g 离心 10min，用 70%的乙醇漂洗 DNA 沉淀 2 次 ，风干后溶于 30μlTE 缓冲液中， UV-2401PC（岛津）紫外分光光度计检测 A260、A280 值并定量，再用 0.8%琼脂糖凝胶
（含 EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小。
注：0.1-0.2g 组织可用 100ul 溶液 E 溶，0.5g 组织，溶液 E 可增加至 300ul，此时 DNA浓度大约为 100ng/ul。
（二）限制性酶切及连接
在 0.2ml 离心管中加入：模板量约为 250ng，2.5μl 10×酶切缓冲液， 2.5μl 10×T4DNA 连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ， 5U MseⅠ，2U T4 连接酶，50pmol MseⅠ接头，双蒸 水补至 25μl。用 PE 公司 PCR 扩增仪设定 37℃过夜反应后，于 65℃20min 灭酶活，－20℃ 保存，作为预扩增模板。
（三）预扩增
取 3μl 酶切连接产物，加入 75ng E+A，75ng M+C 引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag 酶，3μl 10×PCR 缓冲液，加双蒸水补至 30μl。 反应参数为：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30 循环；72℃10min（PE 公 司 PCR 仪）。反应结束后，用 0.8%琼 脂糖凝胶（含 EB0.5μg/ml）电泳检测扩增产物，取 3μl 产物释稀 50 倍，用作选择性扩增模板。
（四）选择性 PCR 扩增
取释稀后的产物 3μl，加入 EcoRⅠ选择性引物、MseⅠ选择性引物各 75ng，15mmol/LMg2+，25mmol/L dNTPs， 1UTag 酶，3μl 10×PCR 缓冲液，加双蒸水补至 30μl。 反应参数为：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13 循环（每循环降 0.7℃）； 94℃30s， 56℃1min， 72℃1min，25 循环；72℃5min（PE 公司 PCR 仪），先用 0.8% 琼脂糖凝胶（含 EB0.5μg/ml）电泳检测先择性扩增产物。
（五）凝胶电泳
扩增产物用 6%变性聚丙烯酰胺胶（厚度 0.5mm）和 1×TBE 电泳缓冲液电泳分离（BIO-RAD 公司测序电泳仪）。拔出梳子，140W 恒功率预电泳 30 分钟，温度达到 47～49℃。务必使 每 个 孔 清 洗 出 尿 素 。 选 择 性 扩 增 产 物 中 加 入 等 体 积 上 样 缓 冲 液 （ 98% 甲 酰 胺 ， 10mmol/LEDTA，0.25% 二甲苯青，0.25%溴酚蓝）94℃变性 5min（PE 公司 PCR 仪）， 结束后迅速置于冰上直到点样。每个泳道加样 8μl。一开始用 100W 恒功率电泳约 2 分钟， 使样品迅速集中到孔底部，再调到 60W 恒功率电泳，温度保持在 43℃左右，至二甲苯青 FF 至玻璃板 2/3 处，结束电泳。
（六）银染
固定液：取 100ml 冰醋酸到 900ml 去离子水或双蒸水中。染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 甲醛，加去离子水至 1L。显色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg 硫代硫酸钠， 加去离子水至 1L。
1、电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盘中。
2、固定：加入固定液，在摇床上轻微震荡 30min。固定结束后，固定液保留。
3、加入去离子水漂洗 3 次，每次 2min。
4、染色：将凝胶放入染色盘中，倒入染色液（4℃），在摇床上轻微震荡 30min。用去离子水漂洗凝胶 10 秒钟后，置入显色盘中。
5、显色：加入显色液（4℃），在摇床上轻微震荡直至条带数不再增加为止。
6、终止：加入 b 步骤用后的固定液，来回漂几分钟。达到最好效果后，用蒸馏水漂洗几分 钟。
7、去除凝胶和玻璃板上的水珠后，放在白光灯箱上用 Nikon 数码相机拍照。
#生物试剂#
AFLP 是通过限制性内切酶片段的不同长度检测 DNA 多态性的一种 DNA 分子标记技术。 本 AFLP 技术主要特点 ：分析所需 DNA 量少，仅需 0.5g；可重复性好；多态性强；分 辨率高；不需要 Southern 杂交；样品适用性广；稳定的遗传性。在技术特点上，AFLP 实 际上是 RAPD 和 RFLP 相结合的一种产物。它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危害 和 RAPD 稳定性差，标记呈现隐性遗传的缺点，同时又兼有二者之长。近几年来，人们不 断将这一技术完善、发展，使得 AFLP 迅速成为迄今为止最有效的分子。
一、 AFLP 原理
AFLP 也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测 DNA多态性的一种 DNA分子标记技术。 但 AFLP 是通过 PCR 反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切 片段在高分辨率的顺序分 析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。实验中酶切片段首先与含有 与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末 端顺序和接头顺序就作为以后 PCR 反应的 引物结合位点。实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了 1～3 个选择性核苷的不同 引物，可以达到选择性扩增的 目的。这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异 配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。
二、实验试剂
Taq 酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI 接头、E+A 引物 M+C 引物、T4DNALigaseE 和 M 引 物、琼脂、过硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸银、甲酰胺、 dNTPs、 二甲苯青、冰醋酸、 玻璃硅烷、50bpMark
三、操作步骤
（一）基因组 DNA 提取和纯化
参考 DNA 实验方法
DNA 的纯化：用 0.8%琼脂糖凝胶（含 EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的 1/3 已提取的基因组 DNA 进行纯化，首先用 TE 缓冲液补满 至总体积 50ul，再等体积苯酚/氯 仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24∶1）各抽提一次， 离心吸上清液于 Eppendorf 管中，加入 1/10 体积的 NaAC 和二倍体积预冷的无水乙醇，－20℃放置 2h 以上，10000g 离心 10min，用 70%的乙醇漂洗 DNA 沉淀 2 次 ，风干后溶于 30μlTE 缓冲液中， UV-2401PC（岛津）紫外分光光度计检测 A260、A280 值并定量，再用 0.8%琼脂糖凝胶
（含 EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小。
注：0.1-0.2g 组织可用 100ul 溶液 E 溶，0.5g 组织，溶液 E 可增加至 300ul，此时 DNA浓度大约为 100ng/ul。
（二）限制性酶切及连接
在 0.2ml 离心管中加入：模板量约为 250ng，2.5μl 10×酶切缓冲液， 2.5μl 10×T4DNA 连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ， 5U MseⅠ，2U T4 连接酶，50pmol MseⅠ接头，双蒸 水补至 25μl。用 PE 公司 PCR 扩增仪设定 37℃过夜反应后，于 65℃20min 灭酶活，－20℃ 保存，作为预扩增模板。
（三）预扩增
取 3μl 酶切连接产物，加入 75ng E+A，75ng M+C 引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag 酶，3μl 10×PCR 缓冲液，加双蒸水补至 30μl。 反应参数为：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30 循环；72℃10min（PE 公 司 PCR 仪）。反应结束后，用 0.8%琼 脂糖凝胶（含 EB0.5μg/ml）电泳检测扩增产物，取 3μl 产物释稀 50 倍，用作选择性扩增模板。
（四）选择性 PCR 扩增
取释稀后的产物 3μl，加入 EcoRⅠ选择性引物、MseⅠ选择性引物各 75ng，15mmol/LMg2+，25mmol/L dNTPs， 1UTag 酶，3μl 10×PCR 缓冲液，加双蒸水补至 30μl。 反应参数为：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13 循环（每循环降 0.7℃）； 94℃30s， 56℃1min， 72℃1min，25 循环；72℃5min（PE 公司 PCR 仪），先用 0.8% 琼脂糖凝胶（含 EB0.5μg/ml）电泳检测先择性扩增产物。
（五）凝胶电泳
扩增产物用 6%变性聚丙烯酰胺胶（厚度 0.5mm）和 1×TBE 电泳缓冲液电泳分离（BIO-RAD 公司测序电泳仪）。拔出梳子，140W 恒功率预电泳 30 分钟，温度达到 47～49℃。务必使 每 个 孔 清 洗 出 尿 素 。 选 择 性 扩 增 产 物 中 加 入 等 体 积 上 样 缓 冲 液 （ 98% 甲 酰 胺 ， 10mmol/LEDTA，0.25% 二甲苯青，0.25%溴酚蓝）94℃变性 5min（PE 公司 PCR 仪）， 结束后迅速置于冰上直到点样。每个泳道加样 8μl。一开始用 100W 恒功率电泳约 2 分钟， 使样品迅速集中到孔底部，再调到 60W 恒功率电泳，温度保持在 43℃左右，至二甲苯青 FF 至玻璃板 2/3 处，结束电泳。
（六）银染
固定液：取 100ml 冰醋酸到 900ml 去离子水或双蒸水中。染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 甲醛，加去离子水至 1L。显色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg 硫代硫酸钠， 加去离子水至 1L。
1、电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盘中。
2、固定：加入固定液，在摇床上轻微震荡 30min。固定结束后，固定液保留。
3、加入去离子水漂洗 3 次，每次 2min。
4、染色：将凝胶放入染色盘中，倒入染色液（4℃），在摇床上轻微震荡 30min。用去离子水漂洗凝胶 10 秒钟后，置入显色盘中。
5、显色：加入显色液（4℃），在摇床上轻微震荡直至条带数不再增加为止。
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https://t.cn/A6WGB8u1 【3515】雅诗兰黛全明星护肤套装
https://t.cn/A6WGB8uk 【950】雅诗兰黛白金粉底液
https://t.cn/A6WGB8um 【860】雅诗兰黛白金大套组
https://t.cn/A6WGB8uu 【490】雅诗兰黛全新三抗防晒
https://t.cn/A6WGB8ug 【1480】雅诗兰黛美白水乳套装
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https://t.cn/A6WGB8Bu 【698】欧莱雅紫熨斗30ml *2
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https://t.cn/A6WGB8rZ 【359】欧莱雅小蜜罐60g
https://t.cn/A6WGB8dw 【419】欧莱雅注白瓶37.6m
https://t.cn/A6WGB8dx 【279】欧莱雅注光水乳2件套
https://t.cn/A6WGB8da 【807】珀莱雅ABC组合
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https://t.cn/A6WGB8dT 【710】毛戈平鱼子气垫
https://t.cn/A6WGB8gL 【449】润百颜hace次抛
https://t.cn/A6WGB8gV 【349】润百颜水润次抛
https://t.cn/A6WGB8gW 【2300】SK-Ⅱ焕颜C
https://t.cn/A6WGB8gr 【199.9】欧诗漫珍珠白套装
https://t.cn/A6WGB8ez 【1680】科兰黎雪藻精华30ml
https://t.cn/A6WGB8ex 【198】理肤泉K乳
https://t.cn/A6WGB8ec 【479】欧莱雅安瓶面膜25片
https://t.cn/A6WGB8ep 【189】MAC水漾唇膏
https://t.cn/A6WGB8eW 【710】朗仕青春肌能三部曲
https://t.cn/A6WGB8en 【351】理肤泉油皮泡沫洁面
https://t.cn/A6WGB8Di 【1970】后天率丹和率提拉礼盒6件套
https://t.cn/A6WGB8Dv 【234】韩束白蛮腰臻白淡斑水乳套装
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https://t.cn/A6WGB8Da 【212】谷雨美白精华
https://t.cn/A6WGB8DE 【2100】雅顿金胶90粒粉胶
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https://t.cn/A6WGB8kO 【4699】OGP极光棒
https://t.cn/A6WGB8kW 【175.5】MAC经典子弹头
https://t.cn/A6WGB8ko 【404】欧莱雅黑金精华
https://t.cn/A6WGB8kT 【299】理肤泉清痘水
https://t.cn/A6WGB8ku 【198】理肤泉特安水乳套
https://t.cn/A6WGB8FQ 【338】理肤泉B5绷带霜
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https://t.cn/A6WGB8Fu 【104】兰水感卸妆油
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https://t.cn/A6WGBRvW 【149】彩棠修容盘
https://t.cn/A6WGBRvi 【159】彩棠妆前乳
https://t.cn/A6WGBRP4 【169】彩棠遮瑕盘
https://t.cn/A6WGBRPb 【380】芭比波朗羽柔蜜粉饼
https://t.cn/A6WGBRPK 【89】瑷尔博士益生菌面膜
https://t.cn/A6WGBRhK 【335】理肤泉特安泡沫
https://t.cn/A6WGBRhk 【1550】希思黎黑玫瑰精华油
https://t.cn/A6WGBR7o 【204】玉泽皮肤屏障修护水乳霜套装
https://t.cn/A6WGBR7J 【297】欧莱雅花萃卸妆油
https://t.cn/A6WGBR7u 【1120】希思黎抗皱修活御致臻颜霜
https://t.cn/A6WGBRzw 【194】韩束聚时光水乳套装
https://t.cn/A6WGBRzm 【114】韩束金刚侠面膜
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https://t.cn/A6WGBRZN 【279】欧莱雅粉妍防晒30ml
https://t.cn/A6WGBRwY 【600】澳尔滨健康水
https://t.cn/A6WGBRwT 【468】珀莱雅红宝石水乳套装
https://t.cn/A6WGBRAP 【79.9】半亩花田洁面慕斯
https://t.cn/A6WGBRAy 【1990】海蓝之谜浓修瓶眼霜
https://t.cn/A6WGBRAX 【429】欧莱雅小蜜罐眼霜20ml
https://t.cn/A6WGBRAk 【385】玫珂菲 定妆散粉
https://t.cn/A6WGBRAB 【1060】后津率享系列礼盒6件套
https://t.cn/A6WGBR2c 【198】理肤泉清痘水乳套
https://t.cn/A6WGBR2C 【676】珀莱雅双抗精华水乳套装
https://t.cn/A6WGBR2N 【1365】珀莱雅全明星套装
https://t.cn/A6WGBRLq 【145】蒂佳婷蓝绿丸面膜
https://t.cn/A6WGBRLZ 【1380】娇兰帝皇蜂姿双效焕新紧塑精华露
https://t.cn/A6WGBRLm 【349】林清轩山茶花抗老精华油
https://t.cn/A6WGBRLj 【168】百雀羚水嫩倍现盈透精华水220ml
https://t.cn/A6WGBRLr 【2800】SK-Ⅱ基础3部曲
https://t.cn/A6WGBRy7 【1350】希思黎黑玫瑰面霜
https://t.cn/A6WGBRyG 【208】Bio-MESO/肌活糙米水乳组合
https://t.cn/A6WGBRyX 【585】润百颜白纱布面膜
https://t.cn/A6WGBRyl 【289.9】欧诗漫小橘灯套装
https://t.cn/A6WGBRUY 【389.9】欧诗漫奢颜套装
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https://t.cn/A6WGBR4h 【249】欧诗漫小橘灯精华
https://t.cn/A6WGBR4x 【319】肌肤未来377美白舱
https://t.cn/A6WGBR49 【168】肌肤未来377美白面膜
https://t.cn/A6WGBR4r 【269】肌肤未来377美白水乳
https://t.cn/A6WGBRbA 【258】肌肤未来377美白面霜30g*2
https://t.cn/A6WGBRbN 【1480】兰嘉丝汀 精华液隔离乳
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https://t.cn/A6WGBRGS 【1029】欧莱雅花蜜王炸
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