AFLP 原理和操作步骤
#生物试剂#
AFLP 是通过限制性内切酶片段的不同长度检测 DNA 多态性的一种 DNA 分子标记技术。 本 AFLP 技术主要特点 ：分析所需 DNA 量少，仅需 0.5g；可重复性好；多态性强；分 辨率高；不需要 Southern 杂交；样品适用性广；稳定的遗传性。在技术特点上，AFLP 实 际上是 RAPD 和 RFLP 相结合的一种产物。它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危害 和 RAPD 稳定性差，标记呈现隐性遗传的缺点，同时又兼有二者之长。近几年来，人们不 断将这一技术完善、发展，使得 AFLP 迅速成为迄今为止最有效的分子。
一、 AFLP 原理
AFLP 也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测 DNA多态性的一种 DNA分子标记技术。 但 AFLP 是通过 PCR 反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切 片段在高分辨率的顺序分 析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。实验中酶切片段首先与含有 与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末 端顺序和接头顺序就作为以后 PCR 反应的 引物结合位点。实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了 1～3 个选择性核苷的不同 引物，可以达到选择性扩增的 目的。这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异 配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。
二、实验试剂
Taq 酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI 接头、E+A 引物 M+C 引物、T4DNALigaseE 和 M 引 物、琼脂、过硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸银、甲酰胺、 dNTPs、 二甲苯青、冰醋酸、 玻璃硅烷、50bpMark
三、操作步骤
（一）基因组 DNA 提取和纯化
参考 DNA 实验方法
DNA 的纯化：用 0.8%琼脂糖凝胶（含 EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的 1/3 已提取的基因组 DNA 进行纯化，首先用 TE 缓冲液补满 至总体积 50ul，再等体积苯酚/氯 仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24∶1）各抽提一次， 离心吸上清液于 Eppendorf 管中，加入 1/10 体积的 NaAC 和二倍体积预冷的无水乙醇，－20℃放置 2h 以上，10000g 离心 10min，用 70%的乙醇漂洗 DNA 沉淀 2 次 ，风干后溶于 30μlTE 缓冲液中， UV-2401PC（岛津）紫外分光光度计检测 A260、A280 值并定量，再用 0.8%琼脂糖凝胶
（含 EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小。
注：0.1-0.2g 组织可用 100ul 溶液 E 溶，0.5g 组织，溶液 E 可增加至 300ul，此时 DNA浓度大约为 100ng/ul。
（二）限制性酶切及连接
在 0.2ml 离心管中加入：模板量约为 250ng，2.5μl 10×酶切缓冲液， 2.5μl 10×T4DNA 连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ， 5U MseⅠ，2U T4 连接酶，50pmol MseⅠ接头，双蒸 水补至 25μl。用 PE 公司 PCR 扩增仪设定 37℃过夜反应后，于 65℃20min 灭酶活，－20℃ 保存，作为预扩增模板。
（三）预扩增
取 3μl 酶切连接产物，加入 75ng E+A，75ng M+C 引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag 酶，3μl 10×PCR 缓冲液，加双蒸水补至 30μl。 反应参数为：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30 循环；72℃10min（PE 公 司 PCR 仪）。反应结束后，用 0.8%琼 脂糖凝胶（含 EB0.5μg/ml）电泳检测扩增产物，取 3μl 产物释稀 50 倍，用作选择性扩增模板。
（四）选择性 PCR 扩增
取释稀后的产物 3μl，加入 EcoRⅠ选择性引物、MseⅠ选择性引物各 75ng，15mmol/LMg2+，25mmol/L dNTPs， 1UTag 酶，3μl 10×PCR 缓冲液，加双蒸水补至 30μl。 反应参数为：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13 循环（每循环降 0.7℃）； 94℃30s， 56℃1min， 72℃1min，25 循环；72℃5min（PE 公司 PCR 仪），先用 0.8% 琼脂糖凝胶（含 EB0.5μg/ml）电泳检测先择性扩增产物。
（五）凝胶电泳
扩增产物用 6%变性聚丙烯酰胺胶（厚度 0.5mm）和 1×TBE 电泳缓冲液电泳分离（BIO-RAD 公司测序电泳仪）。拔出梳子，140W 恒功率预电泳 30 分钟，温度达到 47～49℃。务必使 每 个 孔 清 洗 出 尿 素 。 选 择 性 扩 增 产 物 中 加 入 等 体 积 上 样 缓 冲 液 （ 98% 甲 酰 胺 ， 10mmol/LEDTA，0.25% 二甲苯青，0.25%溴酚蓝）94℃变性 5min（PE 公司 PCR 仪）， 结束后迅速置于冰上直到点样。每个泳道加样 8μl。一开始用 100W 恒功率电泳约 2 分钟， 使样品迅速集中到孔底部，再调到 60W 恒功率电泳，温度保持在 43℃左右，至二甲苯青 FF 至玻璃板 2/3 处，结束电泳。
（六）银染
固定液：取 100ml 冰醋酸到 900ml 去离子水或双蒸水中。染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 甲醛，加去离子水至 1L。显色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg 硫代硫酸钠， 加去离子水至 1L。
1、电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盘中。
2、固定：加入固定液，在摇床上轻微震荡 30min。固定结束后，固定液保留。
3、加入去离子水漂洗 3 次，每次 2min。
4、染色：将凝胶放入染色盘中，倒入染色液（4℃），在摇床上轻微震荡 30min。用去离子水漂洗凝胶 10 秒钟后，置入显色盘中。
5、显色：加入显色液（4℃），在摇床上轻微震荡直至条带数不再增加为止。
6、终止：加入 b 步骤用后的固定液，来回漂几分钟。达到最好效果后，用蒸馏水漂洗几分 钟。
7、去除凝胶和玻璃板上的水珠后，放在白光灯箱上用 Nikon 数码相机拍照。
#生物试剂#
AFLP 是通过限制性内切酶片段的不同长度检测 DNA 多态性的一种 DNA 分子标记技术。 本 AFLP 技术主要特点 ：分析所需 DNA 量少，仅需 0.5g；可重复性好；多态性强；分 辨率高；不需要 Southern 杂交；样品适用性广；稳定的遗传性。在技术特点上，AFLP 实 际上是 RAPD 和 RFLP 相结合的一种产物。它既克服了 RFLP 技术复杂、有放射性危害 和 RAPD 稳定性差，标记呈现隐性遗传的缺点，同时又兼有二者之长。近几年来，人们不 断将这一技术完善、发展，使得 AFLP 迅速成为迄今为止最有效的分子。
一、 AFLP 原理
AFLP 也是通过限制性内切酶片段的不同长度检测 DNA多态性的一种 DNA分子标记技术。 但 AFLP 是通过 PCR 反应先把酶切片段扩增，然后把扩增的酶切 片段在高分辨率的顺序分 析胶上进行电泳，多态性即以扩增片段的长度不同被检测出来。实验中酶切片段首先与含有 与其共同粘末端的人工接头连接，连接后的粘末 端顺序和接头顺序就作为以后 PCR 反应的 引物结合位点。实验中，根据需要通过选择在末端上分别填加了 1～3 个选择性核苷的不同 引物，可以达到选择性扩增的 目的。这些选择性核苷酸使得引物能选择性地识别具有特异 配对顺序的内切酶片段，进行结合，导致特异性扩增。
二、实验试剂
Taq 酶、EcoRI/ MseIEcoRI/ MseI 接头、E+A 引物 M+C 引物、T4DNALigaseE 和 M 引 物、琼脂、过硫酸胺、丙烯酰胺、尿素、硝酸银、甲酰胺、 dNTPs、 二甲苯青、冰醋酸、 玻璃硅烷、50bpMark
三、操作步骤
（一）基因组 DNA 提取和纯化
参考 DNA 实验方法
DNA 的纯化：用 0.8%琼脂糖凝胶（含 EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小，取出其中的 1/3 已提取的基因组 DNA 进行纯化，首先用 TE 缓冲液补满 至总体积 50ul，再等体积苯酚/氯 仿/异戊醇（25：24：1）、氯仿/异戊醇（24∶1）各抽提一次， 离心吸上清液于 Eppendorf 管中，加入 1/10 体积的 NaAC 和二倍体积预冷的无水乙醇，－20℃放置 2h 以上，10000g 离心 10min，用 70%的乙醇漂洗 DNA 沉淀 2 次 ，风干后溶于 30μlTE 缓冲液中， UV-2401PC（岛津）紫外分光光度计检测 A260、A280 值并定量，再用 0.8%琼脂糖凝胶
（含 EB0.5μg/ml）电泳检测片段大小。
注：0.1-0.2g 组织可用 100ul 溶液 E 溶，0.5g 组织，溶液 E 可增加至 300ul，此时 DNA浓度大约为 100ng/ul。
（二）限制性酶切及连接
在 0.2ml 离心管中加入：模板量约为 250ng，2.5μl 10×酶切缓冲液， 2.5μl 10×T4DNA 连接酶切缓冲液，5U EcoRⅠ， 5U MseⅠ，2U T4 连接酶，50pmol MseⅠ接头，双蒸 水补至 25μl。用 PE 公司 PCR 扩增仪设定 37℃过夜反应后，于 65℃20min 灭酶活，－20℃ 保存，作为预扩增模板。
（三）预扩增
取 3μl 酶切连接产物，加入 75ng E+A，75ng M+C 引物，15mmol/L Mg2+，25mmol/L dNTPs，1U Tag 酶，3μl 10×PCR 缓冲液，加双蒸水补至 30μl。 反应参数为：94℃90s；94℃30s，56℃1min，72℃1min，30 循环；72℃10min（PE 公 司 PCR 仪）。反应结束后，用 0.8%琼 脂糖凝胶（含 EB0.5μg/ml）电泳检测扩增产物，取 3μl 产物释稀 50 倍，用作选择性扩增模板。
（四）选择性 PCR 扩增
取释稀后的产物 3μl，加入 EcoRⅠ选择性引物、MseⅠ选择性引物各 75ng，15mmol/LMg2+，25mmol/L dNTPs， 1UTag 酶，3μl 10×PCR 缓冲液，加双蒸水补至 30μl。 反应参数为：94℃90s；94℃30s，65℃1min，72℃1min，13 循环（每循环降 0.7℃）； 94℃30s， 56℃1min， 72℃1min，25 循环；72℃5min（PE 公司 PCR 仪），先用 0.8% 琼脂糖凝胶（含 EB0.5μg/ml）电泳检测先择性扩增产物。
（五）凝胶电泳
扩增产物用 6%变性聚丙烯酰胺胶（厚度 0.5mm）和 1×TBE 电泳缓冲液电泳分离（BIO-RAD 公司测序电泳仪）。拔出梳子，140W 恒功率预电泳 30 分钟，温度达到 47～49℃。务必使 每 个 孔 清 洗 出 尿 素 。 选 择 性 扩 增 产 物 中 加 入 等 体 积 上 样 缓 冲 液 （ 98% 甲 酰 胺 ， 10mmol/LEDTA，0.25% 二甲苯青，0.25%溴酚蓝）94℃变性 5min（PE 公司 PCR 仪）， 结束后迅速置于冰上直到点样。每个泳道加样 8μl。一开始用 100W 恒功率电泳约 2 分钟， 使样品迅速集中到孔底部，再调到 60W 恒功率电泳，温度保持在 43℃左右，至二甲苯青 FF 至玻璃板 2/3 处，结束电泳。
（六）银染
固定液：取 100ml 冰醋酸到 900ml 去离子水或双蒸水中。染色液：1g AgNO3 ，1.5ml 37% 甲醛，加去离子水至 1L。显色液：30g Na2CO3，1.5ml 37% 甲醛，2mg 硫代硫酸钠， 加去离子水至 1L。
1、电泳完毕后，将粘有凝胶的玻璃板置入用于银染的塑料盘中。
2、固定：加入固定液，在摇床上轻微震荡 30min。固定结束后，固定液保留。
3、加入去离子水漂洗 3 次，每次 2min。
4、染色：将凝胶放入染色盘中，倒入染色液（4℃），在摇床上轻微震荡 30min。用去离子水漂洗凝胶 10 秒钟后，置入显色盘中。
5、显色：加入显色液（4℃），在摇床上轻微震荡直至条带数不再增加为止。
6、终止：加入 b 步骤用后的固定液，来回漂几分钟。达到最好效果后，用蒸馏水漂洗几分 钟。
7、去除凝胶和玻璃板上的水珠后，放在白光灯箱上用 Nikon 数码相机拍照。
甲苯罐液位计选型：
此处推荐AHJ-UHZ华捷磁翻板液位计，本体不锈钢材质，内置磁性浮子，面板不锈钢磁性面板，红白翻珠就地显示液位，可以顶部开孔插入法兰固定，也可以侧装开孔法兰固定，根据现场需要，选择合适安装方式。
甲苯罐液位计产品结构图：
https://t.cn/A6c2IAb2
（一）甲苯罐液位计测量原理
不锈钢主体管或外壳，甲苯罐液位计通过法兰或其他接口与容器组成一个连通器，这样腔体内的液面与容器内的液面是相同高度的，故腔体内的浮球会随着容器内液面的升降而升降。这时候我们并不能看到液位，所以我们在腔体的外面装了一个翻柱显示器，它与浮球随液面升降时，它的磁性透过外壳传递给翻柱显示器，推动磁翻柱翻转180°，由于磁翻柱是有红白两个半圆柱合成的圆柱体，所以翻转180°后朝向翻柱显示器外的会改变颜色两色交界处即是液面的高度。
（二）甲苯罐液位计产品参数
1、测量范围：侧装0－200mm、0－18000mm；顶装：0 - 200mm 、0 - 6000mm
超过以上数据请特殊注明要求。
2、测量精度：±10mm
3、介质密度：≥0.5g/cm3
4、工作压力：1.0，1.6，2.5，4.0MPa
5、工作温度：A=80℃，B=120℃，C=300℃
6、介质粘度：≤0.4Pa.S（在介质条件下，L对粘度大或低温时易结晶介质要选用加热夹套）
7、测量界位比重差：≥0.15g/cm3（正常情况都可以满足）
8、本厂出厂连接法兰尺寸：采用化工部1998年发布的HG20592－20635－97法兰标准。若采用其它法兰标准请用户在订货时注明。
（三）甲苯罐液位计选型参数确认
（1）外壳是304/316L不锈钢材质
（2）确认测量的高度，如果已经有安装的法兰孔，请告知上下法兰的中心距。
（3）此处为常温100℃以内（特殊温度请告知）
（4）此处常压1.6MPa（最高做到10MPa）
（5）此处为现场显示（翻珠红白相间的位置就是液位的高度），也可以做成远传（4-20mA、RS485、Hart协议输出）控制。
（四）甲苯罐液位计优点
1、结构简单、坚固牢靠、无需专门维护。
2、直接显示液位高低，不受被测液高温、易流动、易燃烧、有毒等特性的影响。
3、翻板工作无需电源，无需断开的情况下也能显示液位变化和报警。
4、可用于真空、高压、高温的环境，对密度低的液体也可适用。
5、耐腐蚀性能强，适用于大多数腐蚀性液体。
（五）甲苯罐液位计安装注意事项
（1）液位计安装必须垂直，以保证浮球组件在主体管内上下运动自如。
（2）液位计主体周围不容许有导磁体靠近否则直接影响液位计正确工作。
（3）液位计安装完毕后，需要用磁钢进行校正对翻柱导引一次使零位以下显示红色，零位以上显示白色。
（4）开始运行时应先打开下引液管阀门让液体介质平稳进入主体管，避免液体介质带着浮球组件急速上升，而造成翻柱转失灵和乱翻。若发生此现象待液面平稳后可用磁钢重新校正。
甲苯罐液位计顶部安装图：
甲苯罐液位计侧面安装图：
#液位计#
此处推荐AHJ-UHZ华捷磁翻板液位计，本体不锈钢材质，内置磁性浮子，面板不锈钢磁性面板，红白翻珠就地显示液位，可以顶部开孔插入法兰固定，也可以侧装开孔法兰固定，根据现场需要，选择合适安装方式。
甲苯罐液位计产品结构图：
https://t.cn/A6c2IAb2
（一）甲苯罐液位计测量原理
不锈钢主体管或外壳，甲苯罐液位计通过法兰或其他接口与容器组成一个连通器，这样腔体内的液面与容器内的液面是相同高度的，故腔体内的浮球会随着容器内液面的升降而升降。这时候我们并不能看到液位，所以我们在腔体的外面装了一个翻柱显示器，它与浮球随液面升降时，它的磁性透过外壳传递给翻柱显示器，推动磁翻柱翻转180°，由于磁翻柱是有红白两个半圆柱合成的圆柱体，所以翻转180°后朝向翻柱显示器外的会改变颜色两色交界处即是液面的高度。
（二）甲苯罐液位计产品参数
1、测量范围：侧装0－200mm、0－18000mm；顶装：0 - 200mm 、0 - 6000mm
超过以上数据请特殊注明要求。
2、测量精度：±10mm
3、介质密度：≥0.5g/cm3
4、工作压力：1.0，1.6，2.5，4.0MPa
5、工作温度：A=80℃，B=120℃，C=300℃
6、介质粘度：≤0.4Pa.S（在介质条件下，L对粘度大或低温时易结晶介质要选用加热夹套）
7、测量界位比重差：≥0.15g/cm3（正常情况都可以满足）
8、本厂出厂连接法兰尺寸：采用化工部1998年发布的HG20592－20635－97法兰标准。若采用其它法兰标准请用户在订货时注明。
（三）甲苯罐液位计选型参数确认
（1）外壳是304/316L不锈钢材质
（2）确认测量的高度，如果已经有安装的法兰孔，请告知上下法兰的中心距。
（3）此处为常温100℃以内（特殊温度请告知）
（4）此处常压1.6MPa（最高做到10MPa）
（5）此处为现场显示（翻珠红白相间的位置就是液位的高度），也可以做成远传（4-20mA、RS485、Hart协议输出）控制。
（四）甲苯罐液位计优点
1、结构简单、坚固牢靠、无需专门维护。
2、直接显示液位高低，不受被测液高温、易流动、易燃烧、有毒等特性的影响。
3、翻板工作无需电源，无需断开的情况下也能显示液位变化和报警。
4、可用于真空、高压、高温的环境，对密度低的液体也可适用。
5、耐腐蚀性能强，适用于大多数腐蚀性液体。
（五）甲苯罐液位计安装注意事项
（1）液位计安装必须垂直，以保证浮球组件在主体管内上下运动自如。
（2）液位计主体周围不容许有导磁体靠近否则直接影响液位计正确工作。
（3）液位计安装完毕后，需要用磁钢进行校正对翻柱导引一次使零位以下显示红色，零位以上显示白色。
（4）开始运行时应先打开下引液管阀门让液体介质平稳进入主体管，避免液体介质带着浮球组件急速上升，而造成翻柱转失灵和乱翻。若发生此现象待液面平稳后可用磁钢重新校正。
甲苯罐液位计顶部安装图：
甲苯罐液位计侧面安装图：
#液位计#
一加 12手机新配置曝光，配备USB 3.2接口引关注
数码闲聊站今日曝光了一加 12 手机的一些配置信息，引起了广泛关注。这位博主在披露消息时称，一加 12 在某种程度上“违背了祖训”，因为它配备了USB 3.2接口，与以往一加手机的USB Type-C接口不同。
除了USB接口的变化，一加 12 在其他方面也有一系列令人期待的配置。新机将支持50W无线充电，配备“高素质”潜望镜头以及红外遥控等多种功能。此外，根据博主此前的爆料，一加 12 的屏幕形态和边框控制将参考OPPO Find X6 Pro，采用居中单孔设计，顶配提供高达24GB RAM和1TB存储，同时提供黑色、白色和绿色三种配色可选。
一加 12 将搭载一组出色的摄像系统，包括5000万像素的索尼IMX966主摄，支持OIS光学防抖、23mm 焦段、± f / 1.7光圈;超广角镜头为4800万像素，支持14mm 焦段、± f / 2.2光圈;潜望式长焦镜头为6400万像素豪威OV64B，支持OIS光学防抖、70mm 焦段、f / 2.5光圈。
早前，知名爆料人OnLeaks还曝光了一加 12 渲染图，展示了新机的设计风格。此外，一加宣布将于10月24日与京东方共同举行发布会，预计将正式发布一加 12，其中一加 12 将采用京东方的新基材曲面屏，屏幕尺寸为6.82英寸，分辨率为3168×1440p，同时支持120Hz LTPO自适应刷新率。新机的发布备受期待，让我们拭目以待。
数码闲聊站今日曝光了一加 12 手机的一些配置信息，引起了广泛关注。这位博主在披露消息时称，一加 12 在某种程度上“违背了祖训”，因为它配备了USB 3.2接口，与以往一加手机的USB Type-C接口不同。
除了USB接口的变化，一加 12 在其他方面也有一系列令人期待的配置。新机将支持50W无线充电，配备“高素质”潜望镜头以及红外遥控等多种功能。此外，根据博主此前的爆料，一加 12 的屏幕形态和边框控制将参考OPPO Find X6 Pro，采用居中单孔设计，顶配提供高达24GB RAM和1TB存储，同时提供黑色、白色和绿色三种配色可选。
一加 12 将搭载一组出色的摄像系统，包括5000万像素的索尼IMX966主摄，支持OIS光学防抖、23mm 焦段、± f / 1.7光圈;超广角镜头为4800万像素，支持14mm 焦段、± f / 2.2光圈;潜望式长焦镜头为6400万像素豪威OV64B，支持OIS光学防抖、70mm 焦段、f / 2.5光圈。
早前，知名爆料人OnLeaks还曝光了一加 12 渲染图，展示了新机的设计风格。此外，一加宣布将于10月24日与京东方共同举行发布会，预计将正式发布一加 12，其中一加 12 将采用京东方的新基材曲面屏，屏幕尺寸为6.82英寸，分辨率为3168×1440p，同时支持120Hz LTPO自适应刷新率。新机的发布备受期待，让我们拭目以待。
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