中华人民共和国国家标准
GB 31656.3-2021 食品安全国家标准
水产品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹残留量的测定 高效液相色谱法
National food safety standard-Determination of norfloxacin，ciprofloxacin，enrofloxacin，ofloxacin，oxolinic acid and flumequine residues in fishery products by high performance liquid chromatography
（转载自：https://t.cn/A6pdTeln）
1范围
本文件规定了水产品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。
本文件适用于水产品中鱼类肌肉组织虾、蟹、贝类的可食组织中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 30891-2014水产品抽样规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义
4原理
试料中残留的诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹，经酸化乙腈提取，正己烷脱脂，C18固相萃取柱净化，液相色谱荧光检测法测定，外标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1 试剂
5.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
5.1.2甲醇（CH3OH）：色谱纯，
5.1.3 正己烷（C6H14）：色谱纯
5.1.4 盐酸（HCl）。
5.1.5 磷酸（H3PO4）。
5.1.6 氨水（NH3·H2O）。
5.1.7 氢氧化钠（NaOH）。
5.1.8 二水合磷酸二氢钠（NaH2PO•2H2O）。
5.1.9 无水硫酸钠（Na2SO4）。
5.1.10 四丁基溴化铵（C16H36BrN）。
5.2标准品
氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹：含量≥98.0%，详见附录A。
5.3溶液配制
5.3.1盐酸溶液：取盐酸50 mL，加水稀释至100 mL，混匀。
5.3.2磷酸溶液：取磷酸1 mL，加水稀释至10 mL，混匀。
5.3.3酸化乙腈溶液：取乙腈250 mL，加盐酸溶液2 mL，充分混匀。
5.3.4乙腈饱和正己烷溶液：取正己烷200mL于250mL分液漏斗中，加适量乙腈后，剧烈振摇，待分配平衡后，弃去乙腈层，即得。
5.3.5 0. 1 mol/L盐酸溶液：取盐酸9 mL，用水稀释至1 000 mL。
5.3.6 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠4 g，用水溶解并稀释至1 000 mL。
5.3.7 0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液：取二水合磷酸二氢钠1.56g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液79mL溶解，用水稀释至200 mL。
5.3.8 0.01mol/L四丁基溴化铵溶液（pH3.0）：取四丁基溴化铵3.22g，加水900mL使溶解，用磷酸溶液调节pH到3.0，用水稀释至1 000 mL。
5.3.9洗脱液：取氨水25 mL，用甲醇稀释至100 mL。
5.4标准溶液制备
5.4.1诺氟沙星、氧氟沙星标准储备液（100μg/mL）：取诺氟沙星、氧氟沙星各约10mg，精密称定，用0.1 mol/L盐酸溶液10 mL使溶解，用乙腈稀释定容至100 mL棕色容量瓶中，摇匀，即得。4℃以下避光保存，有效期3个月。
5.4.2环丙沙星、恩诺沙星标准储备液（100μg/mL） ：取盐酸环丙沙星、恩诺沙星各约10 mg，精密称定，用甲醇溶解并稀释定容至100 mL棕色容量瓶中，播匀，即得。4℃以下避光保存，有效期3个月。
5.4.3噁喹酸、氟甲喹标准储备液（100μg/ mL） ：取噁喹酸、氟甲喹各约10 mg，精密称定，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液10 mL使溶解，加乙腈稀释定容至100 mL棕色容量瓶中，播匀，即得。4℃以下避光保存，有效期3个月。
5.4.4混合标准工作液（10μg/mL）：精密量取诺氟沙星、氧氟沙星标准储备液，环丙沙星、恩诺沙星标准储备液，噁喹酸、氟甲喹标准储备液各1 mL，于10 mL棕色容量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为10μg/mL混合标准工作液。4℃以下避光保存，有效期1个月。
5.5 材料
C18固相萃取柱：500mg/3mL，或相当者。
6仪器和设备
6.1高效液相色谱仪：配荧光检测器。
6.2 分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3氮吹仪。
6.4 超声波振荡器。
6.5 均质机：15 000 r/min。
6.6 离心机：4 000 r/ min。
6.7尼龙微孔滤膜：0.22μm。
6.8 梨形瓶：100 mL。
6.9分液漏斗：250 mL。
6. 10 旋转蒸发器。
6.11分液漏斗振摇器。
7试样的制备与保存
7.1试样的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，按GB/T 30891-2014中附录B的要求制样。
a）取均质后的供试样品，作为供试试样；
b）取均质后的空白样品，作为空白试样；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2试样的保存
-18℃以下保存，3个月内进行分析检测。
8测定步骤
8.1 提取
称取试样5 g（准确至±0.02 g）， 加酸化乙腈溶液20 mL、无水硫酸钠10 g，高速均质1 min~2 min，3000r/min离心5min，取上清液至分液漏斗，用酸化乙腈溶液20mL，清洗刀头并溶解沉淀，重复提取2次，合并上清液。加乙睛饱和正己烷溶液60 mL，置分液漏斗振摇器（150 r/min）上振荡20 min，静置，取下层乙腈至梨形瓶，40℃旋转蒸发至干。加磷酸盐缓冲液4 mL，超声振荡1 min，静置30 s，溶液转移至15 mL离心管。再重复提取残余物2次，溶液转移至同一离心管，合并3次残余物溶解液，3 0000 r/min离心5 min，取上清液，备用。
8.2 净化
取C18固相萃取柱，依次用甲醇、水磷酸盐缓冲液各3mL活化。取上述备用液过柱，流速控制为每秒1滴。水3mL淋洗，抽干，加洗脱液5mL，收集洗脱液，50℃氮气吹干，加流动相A1.0mL使溶解，过0.22μm微孔滤膜，高效液相色谱测定。
8.3标准曲线的制备
分别精密量取混合标准工作液适量，用流动相A稀释成浓度分别为10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/ mL、2000 ng/mL的系列标准溶液，供高效液相色谱分析；现用现配。以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标，制作标准曲线。
8.4 测定
8.4.1色谱条件
a）色谱柱：C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm），或相当者；
b）流动相：A为0.01 mol/L四丁基溴化铵溶液乙腈（94：6，V/V），B为乙腈，梯度洗脱条件见表1；
image.png
c）流速：0.9 mlL/min；
d）柱温：35℃；
e）进样量：10μL；
f）检测波长：时间程序见表2。
image.png
8.4.2测定法
取试样溶液和标准溶液，作单点或多点校准，按外标法以色谱峰面积定量。标准溶液及试样溶液中目标药物的峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，混合标准溶液色谱图见附录B。
8.5 空白试验
取空白试料，除不加标准溶液外，采用相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中待测药物的残留量按标准曲线或公式（1）计算。
image.png
式中：
X——试样中被测组分残留量的数值
Cs——标准工作液测得的相应被测组分溶液浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
A——试样溶液中相应被测组分峰面积
As——标准溶液中相应被测组分峰面积，
V——试样溶液定容体积的数值，单位为毫升（mL）；
m——试样质量的数值，单位为的（g）。
10 方法灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星的检测限为2.5μg/kg，噁喹酸、氟甲喹的检测限为5μg/kg； 诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星的定量限为5μg/kg，噁喹酸、氟甲喹的定量限为10μg/kg。
10.2准确度
诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星在水5μg/kg~100μg/kg，添加浓度的回收率为70%~120%；噁喹酸、氟甲喹在10μg/kg~100μg/kg，添加浓度的回收率为70%~120%。
10.3精密度
本方法的批內相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。
GB 31656.3-2021 食品安全国家标准
水产品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹残留量的测定 高效液相色谱法
National food safety standard-Determination of norfloxacin，ciprofloxacin，enrofloxacin，ofloxacin，oxolinic acid and flumequine residues in fishery products by high performance liquid chromatography
（转载自：https://t.cn/A6pdTeln）
1范围
本文件规定了水产品中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹残留量检测的制样和高效液相色谱测定方法。
本文件适用于水产品中鱼类肌肉组织虾、蟹、贝类的可食组织中诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹残留量的检测。
2规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 30891-2014水产品抽样规范
3术语和定义
本文件没有需要界定的术语和定义
4原理
试料中残留的诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹，经酸化乙腈提取，正己烷脱脂，C18固相萃取柱净化，液相色谱荧光检测法测定，外标法定量。
5试剂与材料
除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GB/T 6682规定的一级水。
5.1 试剂
5.1.1 乙腈（CH3CN）：色谱纯。
5.1.2甲醇（CH3OH）：色谱纯，
5.1.3 正己烷（C6H14）：色谱纯
5.1.4 盐酸（HCl）。
5.1.5 磷酸（H3PO4）。
5.1.6 氨水（NH3·H2O）。
5.1.7 氢氧化钠（NaOH）。
5.1.8 二水合磷酸二氢钠（NaH2PO•2H2O）。
5.1.9 无水硫酸钠（Na2SO4）。
5.1.10 四丁基溴化铵（C16H36BrN）。
5.2标准品
氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星、噁喹酸、氟甲喹：含量≥98.0%，详见附录A。
5.3溶液配制
5.3.1盐酸溶液：取盐酸50 mL，加水稀释至100 mL，混匀。
5.3.2磷酸溶液：取磷酸1 mL，加水稀释至10 mL，混匀。
5.3.3酸化乙腈溶液：取乙腈250 mL，加盐酸溶液2 mL，充分混匀。
5.3.4乙腈饱和正己烷溶液：取正己烷200mL于250mL分液漏斗中，加适量乙腈后，剧烈振摇，待分配平衡后，弃去乙腈层，即得。
5.3.5 0. 1 mol/L盐酸溶液：取盐酸9 mL，用水稀释至1 000 mL。
5.3.6 0.1 mol/L氢氧化钠溶液：取氢氧化钠4 g，用水溶解并稀释至1 000 mL。
5.3.7 0.05mol/L磷酸盐缓冲溶液：取二水合磷酸二氢钠1.56g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液79mL溶解，用水稀释至200 mL。
5.3.8 0.01mol/L四丁基溴化铵溶液（pH3.0）：取四丁基溴化铵3.22g，加水900mL使溶解，用磷酸溶液调节pH到3.0，用水稀释至1 000 mL。
5.3.9洗脱液：取氨水25 mL，用甲醇稀释至100 mL。
5.4标准溶液制备
5.4.1诺氟沙星、氧氟沙星标准储备液（100μg/mL）：取诺氟沙星、氧氟沙星各约10mg，精密称定，用0.1 mol/L盐酸溶液10 mL使溶解，用乙腈稀释定容至100 mL棕色容量瓶中，摇匀，即得。4℃以下避光保存，有效期3个月。
5.4.2环丙沙星、恩诺沙星标准储备液（100μg/mL） ：取盐酸环丙沙星、恩诺沙星各约10 mg，精密称定，用甲醇溶解并稀释定容至100 mL棕色容量瓶中，播匀，即得。4℃以下避光保存，有效期3个月。
5.4.3噁喹酸、氟甲喹标准储备液（100μg/ mL） ：取噁喹酸、氟甲喹各约10 mg，精密称定，用0.1 mol/L氢氧化钠溶液10 mL使溶解，加乙腈稀释定容至100 mL棕色容量瓶中，播匀，即得。4℃以下避光保存，有效期3个月。
5.4.4混合标准工作液（10μg/mL）：精密量取诺氟沙星、氧氟沙星标准储备液，环丙沙星、恩诺沙星标准储备液，噁喹酸、氟甲喹标准储备液各1 mL，于10 mL棕色容量瓶中，用流动相A稀释至刻度，摇匀，配制成浓度为10μg/mL混合标准工作液。4℃以下避光保存，有效期1个月。
5.5 材料
C18固相萃取柱：500mg/3mL，或相当者。
6仪器和设备
6.1高效液相色谱仪：配荧光检测器。
6.2 分析天平：感量0.00001 g和0.01 g。
6.3氮吹仪。
6.4 超声波振荡器。
6.5 均质机：15 000 r/min。
6.6 离心机：4 000 r/ min。
6.7尼龙微孔滤膜：0.22μm。
6.8 梨形瓶：100 mL。
6.9分液漏斗：250 mL。
6. 10 旋转蒸发器。
6.11分液漏斗振摇器。
7试样的制备与保存
7.1试样的制备
取适量新鲜或解冻的空白或供试组织，按GB/T 30891-2014中附录B的要求制样。
a）取均质后的供试样品，作为供试试样；
b）取均质后的空白样品，作为空白试样；
c）取均质后的空白样品，添加适宜浓度的标准工作液，作为空白添加试样。
7.2试样的保存
-18℃以下保存，3个月内进行分析检测。
8测定步骤
8.1 提取
称取试样5 g（准确至±0.02 g）， 加酸化乙腈溶液20 mL、无水硫酸钠10 g，高速均质1 min~2 min，3000r/min离心5min，取上清液至分液漏斗，用酸化乙腈溶液20mL，清洗刀头并溶解沉淀，重复提取2次，合并上清液。加乙睛饱和正己烷溶液60 mL，置分液漏斗振摇器（150 r/min）上振荡20 min，静置，取下层乙腈至梨形瓶，40℃旋转蒸发至干。加磷酸盐缓冲液4 mL，超声振荡1 min，静置30 s，溶液转移至15 mL离心管。再重复提取残余物2次，溶液转移至同一离心管，合并3次残余物溶解液，3 0000 r/min离心5 min，取上清液，备用。
8.2 净化
取C18固相萃取柱，依次用甲醇、水磷酸盐缓冲液各3mL活化。取上述备用液过柱，流速控制为每秒1滴。水3mL淋洗，抽干，加洗脱液5mL，收集洗脱液，50℃氮气吹干，加流动相A1.0mL使溶解，过0.22μm微孔滤膜，高效液相色谱测定。
8.3标准曲线的制备
分别精密量取混合标准工作液适量，用流动相A稀释成浓度分别为10 ng/mL、50 ng/mL、100 ng/mL、500 ng/mL、1 000 ng/ mL、2000 ng/mL的系列标准溶液，供高效液相色谱分析；现用现配。以峰面积为纵坐标、浓度为横坐标，制作标准曲线。
8.4 测定
8.4.1色谱条件
a）色谱柱：C18色谱柱（150mm×4.6mm，5μm），或相当者；
b）流动相：A为0.01 mol/L四丁基溴化铵溶液乙腈（94：6，V/V），B为乙腈，梯度洗脱条件见表1；
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c）流速：0.9 mlL/min；
d）柱温：35℃；
e）进样量：10μL；
f）检测波长：时间程序见表2。
image.png
8.4.2测定法
取试样溶液和标准溶液，作单点或多点校准，按外标法以色谱峰面积定量。标准溶液及试样溶液中目标药物的峰面积均应在仪器检测的线性范围之内。在上述色谱条件下，混合标准溶液色谱图见附录B。
8.5 空白试验
取空白试料，除不加标准溶液外，采用相同的测定步骤进行平行操作。
9结果计算和表述
试样中待测药物的残留量按标准曲线或公式（1）计算。
image.png
式中：
X——试样中被测组分残留量的数值
Cs——标准工作液测得的相应被测组分溶液浓度的数值，单位为纳克每毫升（ng/mL）；
A——试样溶液中相应被测组分峰面积
As——标准溶液中相应被测组分峰面积，
V——试样溶液定容体积的数值，单位为毫升（mL）；
m——试样质量的数值，单位为的（g）。
10 方法灵敏度、准确度和精密度
10.1灵敏度
本方法诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星的检测限为2.5μg/kg，噁喹酸、氟甲喹的检测限为5μg/kg； 诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星的定量限为5μg/kg，噁喹酸、氟甲喹的定量限为10μg/kg。
10.2准确度
诺氟沙星、环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星在水5μg/kg~100μg/kg，添加浓度的回收率为70%~120%；噁喹酸、氟甲喹在10μg/kg~100μg/kg，添加浓度的回收率为70%~120%。
10.3精密度
本方法的批內相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤15%。
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