折叠屏手机似乎正在成手机行业下一个风口。
从三星、华为到小米，摩托罗拉、中兴也正在入局，折叠屏手机正在成为一个必然趋势，其发展也广受市场和大众的关注。
如今有消息传出，苹果公司也在跟进折叠屏了。
可折叠iPhone或采用全新柔性玻璃
6月15日，海外知名科技博主Jon Prosser爆料称，苹果公司正在研发一款可折叠的iPhone原型机。它是由两块独立的显示屏通过铰链连接组成，并非像三星Galaxy Fold那样采用一块可折叠的大显示屏。虽然是两个独立的显示屏，但Prosser声称这两个显示屏看起来很像是“一块屏幕”。
苹果公司
爆料提到，这款可折叠的iPhone在设计语言上和目前的iPhone 11差不多，机身拥有圆润的不锈钢边框，没有“刘海”，但在显示屏外侧有一个"小小的额头"，用于Face ID。
苹果在铰链上安装屏幕，这就避免了三星Galaxy Fold所出现的设计问题，在屏幕上折叠，对屏幕的损耗非常大。
其实，早在2016年，就不断有传言称苹果一直在研究可折叠设备。
而根据美国专利商标局公布的苹果可折叠显示屏专利申请就可证明该传言。这几年，美国专利商标局就公布苹果多项具有柔性铰链的可折叠iPhone设计专利。
2016年，苹果的第一个可折叠iPhone专利浮出水面，使用柔性OLED显示器和铰链式金属支撑结构。当手机关闭时，显示屏的两部分仍然可以使用。2017年，有传言称苹果将与LG合作开发一款可折叠iPhone。并且美国专利商标局公布了苹果的一份可折叠显示屏的专利申请。2018年，苹果公司又获得了一项具有柔性铰链的可折叠iPhone设计专利。2019年，苹果申请了一款内置加热元件或显示加热功能的可折叠智能手机专利，该专利可以减少手机在低温下的故障。
今年2月，苹果公司获得另一项可折叠设备的专利，该设备带有一个铰链机构，利用可移动的襟翼来防止折叠时显示屏出现折痕或损坏。
今年3月的一项专利描述了一种设备，该设备具有两个独立的显示器，可以将它们放在一起以创建一个带有铰链的可弯曲设备。这项专利的措辞似乎表明，苹果可以创造一个单一的可弯曲的设备，由两个显示器组成，彼此之间无缝沟通。
去年，苹果公司的玻璃供应商康宁曾表示，苹果可折叠手机应该在几年内准备就绪，它的显示屏具有超越其他品牌的独特优点。
康宁称，不同于其他可折叠手机使用基于塑料的显示屏，苹果公司即将推出的可折叠iPhone采用全新的柔性玻璃，“这种显示屏比其他的更为耐用。”
瑞银（UBS）在2019年8月的一份报告中表示，苹果正在“稳步研发可折叠屏技术”，首先是iPad，然后是iPhone，这项技术至少要等到2021年才能进入成熟期。
不过，对于苹果跟进折叠屏手机市场，第一手机界研究院院长孙燕飚则有不一样的看法，孙燕飚表示，从三星第二代折叠屏手机出现热销可以看出，很多高端用户喜欢折叠屏手机，三星的屏幕铰链技术得到了突破，解决了初代出现的问题，若苹果跟进折叠屏手机市场将会率先采用三星的屏幕。
多个细分行业或集体爆发
今年2月，研究机构Strategy Analytics发布告指出，在三星、华为等厂商的引领下，全球可折叠智能手机的出货量将从2019年的不足100万部增长到2025年的1亿部。
该机构副总监Ville-Petteri Ukonaho表示：“可折叠手机将是未来十年高端智能手机市场增长最快的细分市场。”
另一位总监Ken Hyers补充说：“2019年三星是全球排名第一的可折叠智能手机厂商，其次是华为。三星是美国等西方地区的佼佼者，而华为则专注于中国的本土市场。摩托罗拉和TCL等品牌将在2020年推出自己的全新机型，并希望抢占一部分可折叠智能手机市场。到2025年，包括苹果在内，每个主要市场玩家都应该拥有可折叠产品组合。”
业内人士表示，可折叠手机极有可能是智能手机行业的下一个爆发点，而小小的折叠屏有望带动面板减薄、UTG（超薄玻璃）、显示屏、铰链、盖板、液态金属等多个细分行业的爆发。
以UTG（超薄玻璃）为例，天风证券认为，折叠手机的难点在于一体的折叠屏，折叠屏上游材料中柔性材料难度较大，特别是盖板材料，属于高壁垒高价值量环节。UTG（超薄玻璃）或成为重要的新方向，2020年有望被部分机型采用，后续渗透率将持续提升。玻璃减薄是UTG产业链中两个核心环节之一，市场空间将提升。
随着可折叠手机人气渐旺，折叠屏产业链的上市公司也渐渐浮出水面。
折叠屏产业链概念股：
1)材料：PI膜、阻隔膜、ITO导电膜、靶材、玻璃基板、OLED发光物等等原材料。个股包括濮阳惠成、国风塑业、东材科技、丹邦科技、三利谱、隆华科技等。
2)相关设备：包括激光加工设备、检测设备、模组加工设备、贴合设备等。相关个股包括联得装备、智云股份、锦富技术、大族激光、精测电子、劲拓股份等。
3)柔性电路：生益科技、丹邦科技、中京电子、超华科技。
产业链相关上市公司：
同兴达：公司主要从事研发、设计、生产和销售中小尺寸液晶显示模组。公司产品涵盖了COB、TAB、COG等LCD模块产品，TFT、CSTN等彩色LCD显示产品，以及OLED显示产品。
长信科技：公司专注于平板显示真空薄膜材料的研发、生产、销售，致力于自主研发的核心技术“真空薄膜技术”在平板显示行业的应用，是平板显示行业上游关键基础材料的专业供应商。主导产品包括液晶显示(LCD)用ITO导电玻璃(主要是TN/STN-LCD)、触摸屏用ITO导电玻璃、手机面板视窗等三大类产品，并在OLED的应用方面进行了相应的技术储备。
有研新材：公司旗下的有研亿金是国内规模最大的高纯金属溅射靶材制造企业，膜材料是实现柔OLED性的关键，而靶材是电子薄膜材料主要原材料。
联得装备：公司是国内领先的平板显示模组厂商，产品质量优异，与富士康、欧菲光、蓝思科技等知名显示面板厂商合作关系密切。
惠程科技：三星在CES2014上首次小范围展示了可折叠柔性屏幕，其基础材质仍将是塑胶基板(PlasticSubstrate)和类聚酰亚胺膜(Polyimidefilm)，公司投资3亿元增资控股子公司长春高琦用于建设聚酰亚胺纤维大规模产业化项目。
华映科技：公司投资的显示材料实验线就包含了OLED技术研发、人才培训等，公司未来将视OLED技术进展及市场状况积极布局OLED相关产业。
京东方：公司OLED产品已经量产出货。2014年10月，京东方签约拟在成都建设6代LTPS(低温多晶硅)/AMOLED(有机发光二极管)生产线项目，将生产高端手机显示及新兴移动显示等产品。一期项目2017年投产。公司拟投资245亿元在成都上马6代LTPS/AMOLED生产线二期项目，主要生产AMOLED柔性中小尺寸面板。
万润股份：是国内唯一一家同时向三大混合液晶厂商Merck、Chisso及DIC提供TFT液晶单体的厂商，同时也是国际液晶龙头Merck液晶单体的唯一供应商，受益于Merck液晶单体的外包。预计15年将是混晶厂单体业务外包比例提升的第一年，未来两年内，公司将持续受益产业细分趋势。OLED材料有望成为万润股份显示材料新的利润增长点。
欢迎大家补充！
从三星、华为到小米，摩托罗拉、中兴也正在入局，折叠屏手机正在成为一个必然趋势，其发展也广受市场和大众的关注。
如今有消息传出，苹果公司也在跟进折叠屏了。
可折叠iPhone或采用全新柔性玻璃
6月15日，海外知名科技博主Jon Prosser爆料称，苹果公司正在研发一款可折叠的iPhone原型机。它是由两块独立的显示屏通过铰链连接组成，并非像三星Galaxy Fold那样采用一块可折叠的大显示屏。虽然是两个独立的显示屏，但Prosser声称这两个显示屏看起来很像是“一块屏幕”。
苹果公司
爆料提到，这款可折叠的iPhone在设计语言上和目前的iPhone 11差不多，机身拥有圆润的不锈钢边框，没有“刘海”，但在显示屏外侧有一个"小小的额头"，用于Face ID。
苹果在铰链上安装屏幕，这就避免了三星Galaxy Fold所出现的设计问题，在屏幕上折叠，对屏幕的损耗非常大。
其实，早在2016年，就不断有传言称苹果一直在研究可折叠设备。
而根据美国专利商标局公布的苹果可折叠显示屏专利申请就可证明该传言。这几年，美国专利商标局就公布苹果多项具有柔性铰链的可折叠iPhone设计专利。
2016年，苹果的第一个可折叠iPhone专利浮出水面，使用柔性OLED显示器和铰链式金属支撑结构。当手机关闭时，显示屏的两部分仍然可以使用。2017年，有传言称苹果将与LG合作开发一款可折叠iPhone。并且美国专利商标局公布了苹果的一份可折叠显示屏的专利申请。2018年，苹果公司又获得了一项具有柔性铰链的可折叠iPhone设计专利。2019年，苹果申请了一款内置加热元件或显示加热功能的可折叠智能手机专利，该专利可以减少手机在低温下的故障。
今年2月，苹果公司获得另一项可折叠设备的专利，该设备带有一个铰链机构，利用可移动的襟翼来防止折叠时显示屏出现折痕或损坏。
今年3月的一项专利描述了一种设备，该设备具有两个独立的显示器，可以将它们放在一起以创建一个带有铰链的可弯曲设备。这项专利的措辞似乎表明，苹果可以创造一个单一的可弯曲的设备，由两个显示器组成，彼此之间无缝沟通。
去年，苹果公司的玻璃供应商康宁曾表示，苹果可折叠手机应该在几年内准备就绪，它的显示屏具有超越其他品牌的独特优点。
康宁称，不同于其他可折叠手机使用基于塑料的显示屏，苹果公司即将推出的可折叠iPhone采用全新的柔性玻璃，“这种显示屏比其他的更为耐用。”
瑞银（UBS）在2019年8月的一份报告中表示，苹果正在“稳步研发可折叠屏技术”，首先是iPad，然后是iPhone，这项技术至少要等到2021年才能进入成熟期。
不过，对于苹果跟进折叠屏手机市场，第一手机界研究院院长孙燕飚则有不一样的看法，孙燕飚表示，从三星第二代折叠屏手机出现热销可以看出，很多高端用户喜欢折叠屏手机，三星的屏幕铰链技术得到了突破，解决了初代出现的问题，若苹果跟进折叠屏手机市场将会率先采用三星的屏幕。
多个细分行业或集体爆发
今年2月，研究机构Strategy Analytics发布告指出，在三星、华为等厂商的引领下，全球可折叠智能手机的出货量将从2019年的不足100万部增长到2025年的1亿部。
该机构副总监Ville-Petteri Ukonaho表示：“可折叠手机将是未来十年高端智能手机市场增长最快的细分市场。”
另一位总监Ken Hyers补充说：“2019年三星是全球排名第一的可折叠智能手机厂商，其次是华为。三星是美国等西方地区的佼佼者，而华为则专注于中国的本土市场。摩托罗拉和TCL等品牌将在2020年推出自己的全新机型，并希望抢占一部分可折叠智能手机市场。到2025年，包括苹果在内，每个主要市场玩家都应该拥有可折叠产品组合。”
业内人士表示，可折叠手机极有可能是智能手机行业的下一个爆发点，而小小的折叠屏有望带动面板减薄、UTG（超薄玻璃）、显示屏、铰链、盖板、液态金属等多个细分行业的爆发。
以UTG（超薄玻璃）为例，天风证券认为，折叠手机的难点在于一体的折叠屏，折叠屏上游材料中柔性材料难度较大，特别是盖板材料，属于高壁垒高价值量环节。UTG（超薄玻璃）或成为重要的新方向，2020年有望被部分机型采用，后续渗透率将持续提升。玻璃减薄是UTG产业链中两个核心环节之一，市场空间将提升。
随着可折叠手机人气渐旺，折叠屏产业链的上市公司也渐渐浮出水面。
折叠屏产业链概念股：
1)材料：PI膜、阻隔膜、ITO导电膜、靶材、玻璃基板、OLED发光物等等原材料。个股包括濮阳惠成、国风塑业、东材科技、丹邦科技、三利谱、隆华科技等。
2)相关设备：包括激光加工设备、检测设备、模组加工设备、贴合设备等。相关个股包括联得装备、智云股份、锦富技术、大族激光、精测电子、劲拓股份等。
3)柔性电路：生益科技、丹邦科技、中京电子、超华科技。
产业链相关上市公司：
同兴达：公司主要从事研发、设计、生产和销售中小尺寸液晶显示模组。公司产品涵盖了COB、TAB、COG等LCD模块产品，TFT、CSTN等彩色LCD显示产品，以及OLED显示产品。
长信科技：公司专注于平板显示真空薄膜材料的研发、生产、销售，致力于自主研发的核心技术“真空薄膜技术”在平板显示行业的应用，是平板显示行业上游关键基础材料的专业供应商。主导产品包括液晶显示(LCD)用ITO导电玻璃(主要是TN/STN-LCD)、触摸屏用ITO导电玻璃、手机面板视窗等三大类产品，并在OLED的应用方面进行了相应的技术储备。
有研新材：公司旗下的有研亿金是国内规模最大的高纯金属溅射靶材制造企业，膜材料是实现柔OLED性的关键，而靶材是电子薄膜材料主要原材料。
联得装备：公司是国内领先的平板显示模组厂商，产品质量优异，与富士康、欧菲光、蓝思科技等知名显示面板厂商合作关系密切。
惠程科技：三星在CES2014上首次小范围展示了可折叠柔性屏幕，其基础材质仍将是塑胶基板(PlasticSubstrate)和类聚酰亚胺膜(Polyimidefilm)，公司投资3亿元增资控股子公司长春高琦用于建设聚酰亚胺纤维大规模产业化项目。
华映科技：公司投资的显示材料实验线就包含了OLED技术研发、人才培训等，公司未来将视OLED技术进展及市场状况积极布局OLED相关产业。
京东方：公司OLED产品已经量产出货。2014年10月，京东方签约拟在成都建设6代LTPS(低温多晶硅)/AMOLED(有机发光二极管)生产线项目，将生产高端手机显示及新兴移动显示等产品。一期项目2017年投产。公司拟投资245亿元在成都上马6代LTPS/AMOLED生产线二期项目，主要生产AMOLED柔性中小尺寸面板。
万润股份：是国内唯一一家同时向三大混合液晶厂商Merck、Chisso及DIC提供TFT液晶单体的厂商，同时也是国际液晶龙头Merck液晶单体的唯一供应商，受益于Merck液晶单体的外包。预计15年将是混晶厂单体业务外包比例提升的第一年，未来两年内，公司将持续受益产业细分趋势。OLED材料有望成为万润股份显示材料新的利润增长点。
欢迎大家补充！
大家好,我是你们的科普达人小V，上一期我们主要讲细胞凋亡TUNEL的检测方法和实验操作注意点，这次我们来唠一唠凋亡检测的另一个大头——Annexin V法流式凋亡检测。
我们先来回忆一下上期中讲的Annexin V凋亡检测原理：
凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）会从膜内翻到膜外，这是凋亡的一个典型特征，细胞凋亡处于早期阶段时，仅有PS外翻，而细胞膜仍然完整，随着凋亡进程的推移，细胞除了PS外翻以外，细胞膜通透性会改变，可以简单的理解成凋亡后期，细胞膜有穿孔的现象。
接下来我们再来看一下试剂，我们以最常见的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例，试剂盒内一般都是3个组分：两个染料，再加一个为Annexin V标记提供钙离子环境的Binding Buffer。Annexin V本质是一个在钙离子环境下，能够与磷脂酰丝氨酸高度特异性结合的膜联蛋白，通过在该蛋白上标记的荧光基团，我们就可以标记凋亡细胞了，然后再搭配只能够进入受损细胞膜的核酸染料，就可以达到区分各阶段细胞的目的了。
我们将细胞分为三类：一是无PS外翻，也没有细胞膜破裂的健康细胞（两个染料都染不上），二是处于早期凋亡，有PS外翻但是细胞膜完好的细胞（可以染上Annexin V-FITC,不能够染上PI），三是处于晚期凋亡阶段，既存在PS外翻，也存在细胞膜破裂的晚期凋亡细胞（两种染料均可染上），第四类较为特殊，不做赘述，它是无PS外翻但是细胞膜受损的细胞，一般认为这是坏死细胞（可以染上PI，但是无法染上Annexin V-FITC）。
染完色后通过流式细胞仪，我们就能够对细胞群体进行定量和分析了。
以上就是Annexin V法检测凋亡的原理，怎么样是不是超简单~接下来我们来看一下这个实验本身，如何顺利的攻克这个检测呢？
硬核技术一：
细胞收集与染色——如何规范化操作？
Annexin V法的检测主体是流式细胞仪，因此样品必须处理成悬浮细胞的形式才可以上机检测。如果是细胞样品，悬浮细胞直接计数，贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化成细胞悬液后进行后续操作；如果样本是组织，那么需要将其消化成细胞悬液才可以进行后续的实验步骤。
染色操作就非常的简单了，可以概括成以下几步：
（1） 细胞收集，PBS洗涤
（2） Binding Buffer重悬
（3） 染色
（4） 流式检测
一般建议大家收集105个细胞进入洗涤、染色步骤，洗涤时用预冷的PBS洗两遍，然后将PBS吸干净，用Binding Buffer重悬后进行染色，染色时两种染料各加5 µl，避光染色10 min即可终止。
这里要特别提醒一下大家，染色时间不建议延长，避免造成假阳性影响实验结果分析。
硬核技术二：
实验设计——我该拿这么多对照组怎么办？
流式的对照一直很令人头疼，今天小V就来为大家解答一下疑惑。
流式上机除了实验组的双染组之外，还需要添加一系列的对照，用于仪器荧光补偿的调整和后续的数据分析。我们可以将这些对照分为3类。
（1） 空白对照：不进行标记的裸细胞，一般选用待测实验组细胞。目的是看经处理后，细胞本身物理状态是否有变化，也用以进行细胞选群和阴性细胞大致位置的确定。
（2） 阴性对照：双染的不处理正常细胞，目的是排除细胞自身凋亡以及因操作过程带来的凋亡和坏死。另外，健康细胞分界线确定建议用这个对照，因为双染健康细胞相对于不染健康细胞会存在一定的荧光偏移。
（3） 单标组：单一染料标记的实验组细胞（有凋亡细胞）。这一个组别主要是用来进行荧光补偿的调节。流式检测中，荧光信号除了接收通道以外，还可能被另一通道接收到，影响该通道的数据，因此需要进行“补偿调节”，扣除该染料对其他荧光通道的影响。单标组有几种染料就应该做几管，所使用样本应该是该染料检测时，细胞能够有明显区分度的样本。
硬核技术三：
数据分析——救救孩子，怎么搞分析啊？
流式数据的分析是这个实验的重中之重了，我们应该如何操作，才能够得到漂亮的图呢？
首先，我们来认识一下流式分析的检测原理：流式细胞仪通道中一个个的样本流过，仪器会给它一个激发光，这个样本给出的发射光被流式的不同通道所接收，反映在图上就是下图所示的一个个小点（smooth图不以小点的形式显示），这边需要强调的是，流式通道一个个通过去的样品，不一定全是细胞，体系内的细胞碎片，各种小分子杂质只要能够被流式检测到，反映在图谱上，就是一个点。所以严格来说，流式图谱中的点，每个点代表的是一个事件。一般分析我们建议上机时至少采集10000个事件，我们认为这个是能够满足统计学样本分析量的基本要求的。
凋亡数据分析有三个重要步骤：画门、调补偿、画十字门。
1、画门
流式分析给出的第一个图谱，是FSC-SSC物理图谱（图a），这边是小V做的一个凋亡细胞样品，使用 Vazyme #A211 Annexin V-FITC/PI染色，上机分析。首先得到的是图a的FSC-SSC物理图谱，这是之后所有分析的基础。
横纵坐标轴FSC（前向角散射）和SSC（侧向角散射）分别代表了细胞大小和细胞颗粒度，通过这个图谱，我们能根据细胞大小、颗粒度做一个分类。这个分类有两个作用，一是如果两种细胞群在一起，细胞有明显的形态区别，可以做初步的分类，另一个重要作用是可以区分细胞与细胞碎片，如图a所示，我们能够看到很明显的两个群，右上方一群，左下角有一群大小和颗粒度都非常低的事件群体，这一群与右上群体具有明显区分度的事件，被判定为细胞碎片，是必须在后续分析中排除出去的。
为什么一定要出去细胞碎片再进行后续分析呢？
大家可以看图b和图d，图b是图a中所有事件全部划入后续分析得到的结果，图d是把图c中的细胞碎片排除以后进行分析得到的结果。很明显图d的分群比图b优秀太多，细胞碎片真的是一个及其影响分群的东西。
小V要专门另起一行来跟大家强调一下：细胞碎片，请尽力把它排除出你的分析范围！！！
好了，告一段落，搞定了基础的FSC-SSC图谱，成功选到了我们要分析的细胞，也就是做好了第一步：画门。我们接下来应该做什么呢？
2、调补偿
现在的流式细胞仪，调补偿的方法各有不同，有直接上机的时候跑个单染管，仪器自动给你调整好的，也有仪器万事不管，你自己跑完所有样本，回头吭哧吭哧自己做调节的。前者我们就不讲了，我们来讲一讲后者。
首先，必须调节补偿，细胞被激发出来的荧光除了被你设置的那个接收通道接收以外，还有一部分光会逸散到其他通道当中。用FITC作为例子，大家可以看下边这个表格：目标接收通道FL1只能接收到80 %的光，还有20 %散布在其他通道，FL2通道高达10 %，因此不扣除这部分荧光，对你数据分析的影响是非常大的。这个扣除某一荧光素误入到其他荧光通道中的信号的操作，就叫做“调节荧光补偿”。
实验中用到几种荧光，就要准备几种单染管！！
唠完前边这些理论内容，我们来说点实在的。在凋亡实验中，我们如何来调节荧光补偿呢？
这边小V推荐大家拿到原始数据以后，用Flowjo V10进行荧光补偿的调节，软件自动，不用发愁～这个操作分为3步
（1） 在FSC-SSC图中，选出待分析细胞群，一定尽量扔掉细胞碎片！
（2） 打开Flowjo的补偿调节界面，按需选择样品、阴性、阳性。Positive一般软件会自动选择，大家不用在意，请重点关注Sample和Negative，Sample是你的单染管，Negative指的是不含该染料的体系，一般统一用不染色的对照组就行了。
（3） 请点击Apply to Group按钮，选中对应的数据组，简单模式的你的补偿就已经OK了~
3、画十字门
最后呢我们来唠一下关于结果怎么看的那些事儿~
我们通过十字门，将细胞分为了四个象限（见图4），分别对应了四种不同的染色情况，左下象限是两个染料都没染到的健康细胞，右下是染上了Annexin V-FITC，没染上PI的早期凋亡细胞，右上象限我们一般情况下把它判定为晚期凋亡细胞（FITC和PI都能染上），但实际情况中，右上象限也是包括了一部分坏死细胞的，但是比例比较小，一般是忽略掉的。左上象限是坏死细胞（不经凋亡，因此没有PS外翻，但是细胞坏死后细胞膜损坏，因此核酸染料可以进入）。
讲完了结果的四个象限划分，我们回到四个象限本身，这个十字门该怎么画呢？
这边小V给到大家一个最优的画法~大家可以掏出你调节好补偿的数据，找出两个单染组，然后根据单染组的分群大致画出横纵坐标轴的荧光强度分界，然后在双染的数据中以这两个分界为基准，结合数据的实际分群情况进行微调，就是属于你数据的十字门了~这边也是强调一下，需要一起分析的数据们，都必须用统一的十字门哟！
最后，有几个点需要补充说明一下，也是大家经常遇到的一些问题：
1. 我的细胞贴壁非常的厉害，不含EDTA胰酶我都得消化个15、20分钟，怎么办？
遇到这种情况，小V建议你两害相权取其轻，Binding Buffer里最重要的组分是钙离子，建议大家用不含EDTA的胰酶是因为EDTA螯合剂会把钙离子扯下来，降低Annexin V的标记效率。但是如果消化要花费15分钟甚至更久，会引入很多机械性损伤，对于数据分析有很大的影响。所以这种时候用含EDTA的胰酶也是可以的，但是后续一定要洗涤干净。
2. 我能不能延长染色时间啊？我觉得10分钟染色，好像染得不够多啊？
不可以的哦，10分钟是最优化的染色时间，染色时间过长的情况下会产生假阳性，不利于真实的实验结果分析。
3. 我的细胞因为种种原因，就是没办法好好分群，我该怎么画门呢？
这里首先要同情一下这位同学，然后要告诉大家，遇到这种情况，可做一个健康细胞双染（同一份健康细胞，加染料与不加染料，其本底荧光值会有偏移，因此这边必须进行双染），健康细胞肯定是染不上染料的，那么你就得到了一团在左下角的细胞，以一团细胞的边界为标准画十字门，然后统一用这个十字门就可以了。
4. 我这边没有流式，我该在哪里停止实验啊？
收集好细胞后，经PBS洗涤并用Binding Buffer重悬，放置在冰上去平台处染色然后上机即可。中间时间不宜过长，否则细胞状态容易变差。
友情提醒：如果细胞本身凋亡就非常多，那么转移过程可能导致细胞状态急速变差。因此需要根据细胞本身特性和药物处理后细胞状态进行综合判断，建议针对不同实验条件开展优化。
好啦~今天的课小V就讲到这里了，如果大家在实验方面有任何疑问， 欢迎随时咨询小V，或直接联系您身边的诺唯赞人，我们将努力为您提供更优质的产品和服务！最后，祝福大家实验顺当结果好，细胞超乖不作妖！
我们先来回忆一下上期中讲的Annexin V凋亡检测原理：
凋亡早期，细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（PS）会从膜内翻到膜外，这是凋亡的一个典型特征，细胞凋亡处于早期阶段时，仅有PS外翻，而细胞膜仍然完整，随着凋亡进程的推移，细胞除了PS外翻以外，细胞膜通透性会改变，可以简单的理解成凋亡后期，细胞膜有穿孔的现象。
接下来我们再来看一下试剂，我们以最常见的Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒为例，试剂盒内一般都是3个组分：两个染料，再加一个为Annexin V标记提供钙离子环境的Binding Buffer。Annexin V本质是一个在钙离子环境下，能够与磷脂酰丝氨酸高度特异性结合的膜联蛋白，通过在该蛋白上标记的荧光基团，我们就可以标记凋亡细胞了，然后再搭配只能够进入受损细胞膜的核酸染料，就可以达到区分各阶段细胞的目的了。
我们将细胞分为三类：一是无PS外翻，也没有细胞膜破裂的健康细胞（两个染料都染不上），二是处于早期凋亡，有PS外翻但是细胞膜完好的细胞（可以染上Annexin V-FITC,不能够染上PI），三是处于晚期凋亡阶段，既存在PS外翻，也存在细胞膜破裂的晚期凋亡细胞（两种染料均可染上），第四类较为特殊，不做赘述，它是无PS外翻但是细胞膜受损的细胞，一般认为这是坏死细胞（可以染上PI，但是无法染上Annexin V-FITC）。
染完色后通过流式细胞仪，我们就能够对细胞群体进行定量和分析了。
以上就是Annexin V法检测凋亡的原理，怎么样是不是超简单~接下来我们来看一下这个实验本身，如何顺利的攻克这个检测呢？
硬核技术一：
细胞收集与染色——如何规范化操作？
Annexin V法的检测主体是流式细胞仪，因此样品必须处理成悬浮细胞的形式才可以上机检测。如果是细胞样品，悬浮细胞直接计数，贴壁细胞使用不含EDTA的胰酶消化成细胞悬液后进行后续操作；如果样本是组织，那么需要将其消化成细胞悬液才可以进行后续的实验步骤。
染色操作就非常的简单了，可以概括成以下几步：
（1） 细胞收集，PBS洗涤
（2） Binding Buffer重悬
（3） 染色
（4） 流式检测
一般建议大家收集105个细胞进入洗涤、染色步骤，洗涤时用预冷的PBS洗两遍，然后将PBS吸干净，用Binding Buffer重悬后进行染色，染色时两种染料各加5 µl，避光染色10 min即可终止。
这里要特别提醒一下大家，染色时间不建议延长，避免造成假阳性影响实验结果分析。
硬核技术二：
实验设计——我该拿这么多对照组怎么办？
流式的对照一直很令人头疼，今天小V就来为大家解答一下疑惑。
流式上机除了实验组的双染组之外，还需要添加一系列的对照，用于仪器荧光补偿的调整和后续的数据分析。我们可以将这些对照分为3类。
（1） 空白对照：不进行标记的裸细胞，一般选用待测实验组细胞。目的是看经处理后，细胞本身物理状态是否有变化，也用以进行细胞选群和阴性细胞大致位置的确定。
（2） 阴性对照：双染的不处理正常细胞，目的是排除细胞自身凋亡以及因操作过程带来的凋亡和坏死。另外，健康细胞分界线确定建议用这个对照，因为双染健康细胞相对于不染健康细胞会存在一定的荧光偏移。
（3） 单标组：单一染料标记的实验组细胞（有凋亡细胞）。这一个组别主要是用来进行荧光补偿的调节。流式检测中，荧光信号除了接收通道以外，还可能被另一通道接收到，影响该通道的数据，因此需要进行“补偿调节”，扣除该染料对其他荧光通道的影响。单标组有几种染料就应该做几管，所使用样本应该是该染料检测时，细胞能够有明显区分度的样本。
硬核技术三：
数据分析——救救孩子，怎么搞分析啊？
流式数据的分析是这个实验的重中之重了，我们应该如何操作，才能够得到漂亮的图呢？
首先，我们来认识一下流式分析的检测原理：流式细胞仪通道中一个个的样本流过，仪器会给它一个激发光，这个样本给出的发射光被流式的不同通道所接收，反映在图上就是下图所示的一个个小点（smooth图不以小点的形式显示），这边需要强调的是，流式通道一个个通过去的样品，不一定全是细胞，体系内的细胞碎片，各种小分子杂质只要能够被流式检测到，反映在图谱上，就是一个点。所以严格来说，流式图谱中的点，每个点代表的是一个事件。一般分析我们建议上机时至少采集10000个事件，我们认为这个是能够满足统计学样本分析量的基本要求的。
凋亡数据分析有三个重要步骤：画门、调补偿、画十字门。
1、画门
流式分析给出的第一个图谱，是FSC-SSC物理图谱（图a），这边是小V做的一个凋亡细胞样品，使用 Vazyme #A211 Annexin V-FITC/PI染色，上机分析。首先得到的是图a的FSC-SSC物理图谱，这是之后所有分析的基础。
横纵坐标轴FSC（前向角散射）和SSC（侧向角散射）分别代表了细胞大小和细胞颗粒度，通过这个图谱，我们能根据细胞大小、颗粒度做一个分类。这个分类有两个作用，一是如果两种细胞群在一起，细胞有明显的形态区别，可以做初步的分类，另一个重要作用是可以区分细胞与细胞碎片，如图a所示，我们能够看到很明显的两个群，右上方一群，左下角有一群大小和颗粒度都非常低的事件群体，这一群与右上群体具有明显区分度的事件，被判定为细胞碎片，是必须在后续分析中排除出去的。
为什么一定要出去细胞碎片再进行后续分析呢？
大家可以看图b和图d，图b是图a中所有事件全部划入后续分析得到的结果，图d是把图c中的细胞碎片排除以后进行分析得到的结果。很明显图d的分群比图b优秀太多，细胞碎片真的是一个及其影响分群的东西。
小V要专门另起一行来跟大家强调一下：细胞碎片，请尽力把它排除出你的分析范围！！！
好了，告一段落，搞定了基础的FSC-SSC图谱，成功选到了我们要分析的细胞，也就是做好了第一步：画门。我们接下来应该做什么呢？
2、调补偿
现在的流式细胞仪，调补偿的方法各有不同，有直接上机的时候跑个单染管，仪器自动给你调整好的，也有仪器万事不管，你自己跑完所有样本，回头吭哧吭哧自己做调节的。前者我们就不讲了，我们来讲一讲后者。
首先，必须调节补偿，细胞被激发出来的荧光除了被你设置的那个接收通道接收以外，还有一部分光会逸散到其他通道当中。用FITC作为例子，大家可以看下边这个表格：目标接收通道FL1只能接收到80 %的光，还有20 %散布在其他通道，FL2通道高达10 %，因此不扣除这部分荧光，对你数据分析的影响是非常大的。这个扣除某一荧光素误入到其他荧光通道中的信号的操作，就叫做“调节荧光补偿”。
实验中用到几种荧光，就要准备几种单染管！！
唠完前边这些理论内容，我们来说点实在的。在凋亡实验中，我们如何来调节荧光补偿呢？
这边小V推荐大家拿到原始数据以后，用Flowjo V10进行荧光补偿的调节，软件自动，不用发愁～这个操作分为3步
（1） 在FSC-SSC图中，选出待分析细胞群，一定尽量扔掉细胞碎片！
（2） 打开Flowjo的补偿调节界面，按需选择样品、阴性、阳性。Positive一般软件会自动选择，大家不用在意，请重点关注Sample和Negative，Sample是你的单染管，Negative指的是不含该染料的体系，一般统一用不染色的对照组就行了。
（3） 请点击Apply to Group按钮，选中对应的数据组，简单模式的你的补偿就已经OK了~
3、画十字门
最后呢我们来唠一下关于结果怎么看的那些事儿~
我们通过十字门，将细胞分为了四个象限（见图4），分别对应了四种不同的染色情况，左下象限是两个染料都没染到的健康细胞，右下是染上了Annexin V-FITC，没染上PI的早期凋亡细胞，右上象限我们一般情况下把它判定为晚期凋亡细胞（FITC和PI都能染上），但实际情况中，右上象限也是包括了一部分坏死细胞的，但是比例比较小，一般是忽略掉的。左上象限是坏死细胞（不经凋亡，因此没有PS外翻，但是细胞坏死后细胞膜损坏，因此核酸染料可以进入）。
讲完了结果的四个象限划分，我们回到四个象限本身，这个十字门该怎么画呢？
这边小V给到大家一个最优的画法~大家可以掏出你调节好补偿的数据，找出两个单染组，然后根据单染组的分群大致画出横纵坐标轴的荧光强度分界，然后在双染的数据中以这两个分界为基准，结合数据的实际分群情况进行微调，就是属于你数据的十字门了~这边也是强调一下，需要一起分析的数据们，都必须用统一的十字门哟！
最后，有几个点需要补充说明一下，也是大家经常遇到的一些问题：
1. 我的细胞贴壁非常的厉害，不含EDTA胰酶我都得消化个15、20分钟，怎么办？
遇到这种情况，小V建议你两害相权取其轻，Binding Buffer里最重要的组分是钙离子，建议大家用不含EDTA的胰酶是因为EDTA螯合剂会把钙离子扯下来，降低Annexin V的标记效率。但是如果消化要花费15分钟甚至更久，会引入很多机械性损伤，对于数据分析有很大的影响。所以这种时候用含EDTA的胰酶也是可以的，但是后续一定要洗涤干净。
2. 我能不能延长染色时间啊？我觉得10分钟染色，好像染得不够多啊？
不可以的哦，10分钟是最优化的染色时间，染色时间过长的情况下会产生假阳性，不利于真实的实验结果分析。
3. 我的细胞因为种种原因，就是没办法好好分群，我该怎么画门呢？
这里首先要同情一下这位同学，然后要告诉大家，遇到这种情况，可做一个健康细胞双染（同一份健康细胞，加染料与不加染料，其本底荧光值会有偏移，因此这边必须进行双染），健康细胞肯定是染不上染料的，那么你就得到了一团在左下角的细胞，以一团细胞的边界为标准画十字门，然后统一用这个十字门就可以了。
4. 我这边没有流式，我该在哪里停止实验啊？
收集好细胞后，经PBS洗涤并用Binding Buffer重悬，放置在冰上去平台处染色然后上机即可。中间时间不宜过长，否则细胞状态容易变差。
友情提醒：如果细胞本身凋亡就非常多，那么转移过程可能导致细胞状态急速变差。因此需要根据细胞本身特性和药物处理后细胞状态进行综合判断，建议针对不同实验条件开展优化。
好啦~今天的课小V就讲到这里了，如果大家在实验方面有任何疑问， 欢迎随时咨询小V，或直接联系您身边的诺唯赞人，我们将努力为您提供更优质的产品和服务！最后，祝福大家实验顺当结果好，细胞超乖不作妖！
#FF14# 最近入坑的朋友很多，可能也和各种宣传也有关系，这里也给入门的新人一些小贴士吧。无论你是朋友推荐，还是最近看秦先生啊大pi啊这些主播直播感兴趣，亦或是看到媒体的介绍入坑，都欢迎看一下这些贴士，希望对你们有用。
1.关于直升的使用，如果你是第一次玩这个游戏，建议将直升留给副职，自己体验一个主职从1～60的过程，方便你适应游戏，不至于直升后茫然。如果你不是第一次玩这种游戏，并且对于剧情不太关注，或者已经了解了50级之前的剧情，可以直升，当你想回顾曾经的剧情的时候，可以去任何一个主城的旅馆看冒险笔记。
2.前期2.5秒的公共CD战斗起来很困怎么办？加快升级的脚步，大部分职业在30级之后就已经有了不少能力技能可以穿插并且副本难度也会开始变高，从那之后战斗也逐渐不枯燥了。(目前升级所需的经验已经少了所以30级之前只做主线已经基本不会卡主线了)
3.当我满级了一个职业之后该做什么？主线是最优先的，其次是除了转职以外的大部分带+号的支线，每周的450圣典点数尽量刷满，并且找到一个组织(最好是气氛活跃的部队)，在部队成员的带领下进行更核心的内容的推进。
4.无论何时，只要在新手时期，一定要尽可能待在新手频道，并且有任何游戏上问题都可以向导师提问，导师永远是你们新手时期最好的伙伴。
相信你们在我的这4条贴士下能愉快地堵过新手期并逐渐发现这个目前MMO界排行第二的游戏的真正魅力。倾听……感受……思考……愿水晶给予你们指引[爱你]
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