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细胞无菌检测
无菌检测 sterility testing

----利用方法对细胞中细菌、真菌、支原体和病毒检验的过程。包括是否有污染及确定具体污染

一、一般要求
应根据细胞来源、潜在污染暴露史、细胞预期应用目的及所处环境等方面对细胞进行风险评估。考虑的因素包括但不限于以下几个方面:
a)应考虑细胞样本源。来自不同物种的细胞很可能携带潜在的微生物;
b) 应根据细胞的使用目的进行相关污染检测;
c)考虑细备和细胞培养的全周期所处的环境因素。根据暴露史评估可能的污染,如用于培养细胞的动物血清可能被特定的微生物污染。
依据风险评估判可能性最大的微生物污染类型,评估现有检验方法的话用性为待检测样本选择合适的方法。

二、方法选择
1.总体要求
在选择检测方法时,应了解该方法原理、微生物类型以及灵敏度等。
选择检测方法应依据预期目的、样本特性和处理因素。
选择的方法应经过验证或确认。

2.细菌和真菌
细菌是一大类普遍存在的单细胞微生物。细菌的直径通常只有几微米,其形状多样,如球状、杆状和螺旋状等。由于分布广泛、生长迅速和体积大小等特点,细菌以及酵母和霉菌是细胞培养中最常见的生物污染物。
细菌污染在培养物感染后几天内就很容易被肉眼观察到;受感染的培养物通常会变得浑浊,有时表面会有一层薄膜。经常还会出现培养基的pH值突然下降的情况。在低倍显微镜下,细菌以细小颗粒的形式出现在细胞之间,在高倍显微镜下观察可以分辨出单个细菌的形状。下面的模拟图像显示了贴壁培养的293细胞被大肠杆菌污染。
(1)依据需要选择适用干细菌和真菌的检测方法,如直接镜检法、膜过滤法、直接接种法、PCR法、MNP标记法、飞行时间质谱等。
(2)初步判断是否有细菌或真菌污染物,宜采用直接镜检法。
(3)若试验样品性质如可行,应首先选择膜过滤法进行检测。
(4)直接接种法对干细胞培养体系中添加抗生素的样品应考虑抗生素对细菌和直菌的抑制效应而影响检测的敏感性。
(5)利用PCR的方法检测细菌16SrRNA高保守区的序列来判断是否有细菌污染。利用PCR的方法检测细菌16SrRNA可变区的序列和MNP标记序列分析污染细菌的种属,利用MNPITS1或ITS2等序列判断感染真菌的种属。
(6)对微生物的组分进行检测可采用飞行时间质谱法等。

3.病毒
病毒是一种微小的感染性病原体,利用宿主细胞的结构进行繁殖。它们的体积极小, 难以在培养中被检测到,也难以从细胞培养实验室使用的试剂中去除。由于大多数 病毒对宿主有非常严格的要求,因此,它们通常不会对宿主以外物种的细胞培养物产生不良影响。但被病毒感染的细胞培养物会对实验室人员造成严重的健康威胁, 尤其是当实验室培养的是人类或灵长类的细胞时。要检测细胞培养物是否被病毒感染,可以使用电子显微镜观察、用抗体组合进行免疫染色、ELISA检测或是使用合适 的病毒引物进行PCR扩增。
(1)依据需要选择适用干病毒检测的方法,如直接镜检法、细胞形态观察及血吸附试验、体外不同细胞接种法、动物检查法、鸡胚接种检查法、PCR法、高通最测序法、基因片技术、荧光免疫法、酶联免疫法和血细胞凝集试验等方法。
(2)可利用光学显微镜观察病毒感染导致的细胞病变合胞体的形成:可通过电子显微镜观察大小和形态来识别病毒;可通过免疫电镜技术识别病毒。
(3)取细胞培养物的上清液或细胞培养物的裂解物,接种已知未污染病毒的相应细胞,检测是否出现细胞病变,或采用血细胞的吸附现象检测待检细胞培养物是否污染病毒。
(4)若采用动物检查法,可通过对普通动物或者含有特定病原体的动物,如小(包括乳鼠和成鼠)
豚鼠、仓鼠、家兔和非人灵长类动物等进行颅内、腹腔、鼻腔和皮下等部位接种,判断是否有病毒感染。
(5)分离黏液病毒、疱疹病毒和痘病毒宜采用鸡胚接种检查法。鸡胚应来自无特定病原(SPF)鸡群。
(6)采用PCR法检测病毒核酸高保守区的序列来判新是否有病毒污染。
(7)可采用高通量测序法鉴定病毒特异性序列。
(8)采用基因芯片技术检测病毒,需要合成与潜在污染的病毒基因组上的特定区域互补的核酸探针。
(9)用病毒抗原特异的抗体,通过荧光免疫反应用荧光显微镜检测细胞内病毒蛋白来判断特定的病毒污染。
(10)运用病毒抗原特异的抗体,通过酶联免疫反应检测细胞内或者上清液中的病毒蛋白来判断特定的病毒污染。
(11)通过凝集血细胞检测上清液中的病毒颗粒,如用鸡红细胞检测流感病毒。

4.支原体
支原体是无细胞壁的简单细菌,被认为是最小的自我复制生物。由于支原体非常小( 通常小于1 µm),因此很难被检测到,除非它们达到了极高的密度,导致细胞培养物变质;在此之前,通常没有明显的感染迹象。一些生长缓慢的支原体可在培养物中持续存活,而不会导致细胞死亡,但它们可以改变培养体系中宿主细胞的行为和代谢。
(1)依据需要选择适用于支原体检测的方法,如培养法、指示细胞培养DNA染色法、PCR法、荧光原位杂交法、腺苷磷酸化酶活性检测法等方法。
(2)若对支原体检测结果报告时间没有急切要求的,宜选择培养法进行检测。
(3)利用DNA热色法,经荧光显微镜下观察看到有附着在细胞表面的大小不等,不规则的荧光着色颗粒则表明存在支原体污染。
(4)通过PCR法检测支原体16SrRNA序列保守区特异性序列来判定是否存在支原体。
(5)利用带光原位杂交法检测支原体,需要设计与支原体rRNA的高度保守区域互补的蒙光探针。
(6)腺苷磷酸化酶活性检测法不适用于本身腺苷磷酸化酶活性高的细胞。

5.过程控制
样品
(1)应根据所选方法,确定足够量的供试样品。
(2)应根据供试样品可能的稳定性考虑其储存条件。
(3)应实行严格微生物规范操作,避免取样讨程中微生物污染。

试剂材料和仪器设备用具
(1)应考虑设备、试剂和耗材对微生物检测的影响。
(2)检测过程中应使用标准物质。
(3)应根据样品尺寸选择适宜的容器,避免蒸发、确保无微生物、无毒、无浸出。
(4)应配备与微生物检测能力和工作量相适应的仪器设备,其类型、测量范围和准确度应符合检测要求。
(5)检测所用试剂应贮存在适的环境中,以确保试剂的稳定性。
(6)用于微生物检测的溶液、稀释剂或冲洗剂以及所使用的耗材若是作为微生物检测测试样品的成分,则不应具有抗微生物活性的特性。

操作
(1)待测样品的收集操作应确保无污染引人。
(2)应依据微生物的最佳生长条件和营养需求选择专门的分离方法进行检测。
(3)应根据微生物的生长速度,以获得足够数量的生物体。
(4)应考虑某些微生物种类和真菌是否形成孢子。
(5)应考虑细胞培养过程中受支原体污染时,支原体可能黏附在细胞膜上仅以最低水平浓度存在于培养上清液中。
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野拔子,中药名。
为唇形科植物细皱香薷的全草。
别名
香苏草、野苏、野香苏、崩疮药、扫把茶、腊悠麻、小苏苏棵、野香薷、狗尾巴香、山香、鬼米香条、小野菝子、满山香、小坝子。
我们那叫狗尾巴香或狗屎香,只有每年冬季开花,花期非常短。小时候上山找烧柴或放猪放牛采蘑菇经常看到,但我确切地没认清这种植物,更不知道它的作用。
有两次在昆明的餐馆里,我竟然吃到了放狗尾巴香煮的鸡,“野坝子气锅鸡”这道特色菜,被堂而皇之地摆了宴席,突然觉得这种来自乡野,被很多不认识的人轻贱和忽视的不起眼的植物,珍贵了起来。原来不是人家没有价值,而是不被人们认识和利用而已,白白浪费了一种自然资源。在《全国中草药汇编》《云南中草药选》《昆明民间常用草药》中,都有对香苏草的记载。
在高温多雨的夏天,大自然里多腐烂,湿热之气蒸腾,会产生一些秽浊、疫戾之气,医书中称之为“山岚不正之邪”。比如,古人说的“岭南多疫瘴”,即是。因而会引发疾病,该怎么去防范和治疗呢?例如,云南楚雄的彝族,有一道“野坝子茶”,即采香苏草的嫩尖叶晒干,然后用来泡水喝。
养生之道不远人,百姓日用而不知,这一道茶就是芳香辟秽的具体实践,非常值得我们去效法。

性味辛、苦、凉的香苏草,具有清热解毒,消食化积,止血止痛,用于伤风感冒,消化不良,腹痛腹胀,痢疾,咳血,风湿关节痛,外伤出血,烂疮,蛇咬伤等多种药用的价值,也算全身是宝了。
香苏草,味辛而有芳香之气,能升,能散,可以引清阳出上窍(辛开);味苦而性凉,能降,能泄,可以引浊阴出下窍(苦降)。

中医里说“芳香辟秽”,此话怎讲?清代医学大家,徐灵胎《神农本草经百种录》中讲:“芳香者,气之正,正气盛则除邪避秽也”。

天然本草的芳香之气,是天地间清阳正气,可以驱散一切污、秽、浊、戾的邪气。既可以直接辟外邪,又可以经口鼻窍道吸入人体,清除体内的秽浊之气,还可以扶助人体的正气。

在“芳香辟秽”这个原理下,诞生了各式各样的芳香疗法,或吸入,或饮入,或药浴......芳香之气善行,进入人体之后,可以通行十二经络,透达五脏六腑,无处不到。古人云:“病人游于药市,闻众香药,病自衰减”,这就是芳香药物扶正祛邪的效果。

李时珍说:“土喜暖而爱芳香”。脾是太阴湿土,胃是阳明燥土,在五脏六腑中,脾胃最偏爱芳香之气。因此,治疗脾胃的疾病,最宜用芳香药物,好比是给小姐姐送礼物,投其所好。

我们腹胀、腹泻的时候,去找中医看病,问医生这是什么原因引起的?中医甩给你四个字:“脾胃不和”。你听了也白听,还是什么也没听明白。
要想弄明白,须得看医经,《素问.阴阳应象大论》:“清气在下,则生飧泄;浊气在上,则生胀。此阴阳反作,病之逆从也”。
你是不是越看越懵了,这医经中哪有提到脾胃呀?

脾主升清,胃主降浊。脾以升为顺,胃以降为和,这是正常的生理状态。如果反过来,就是上段经文之意:脾的清阳之气不往上升,反而往下降,就会出现腹泻,而且是完谷不化的腹泻,吃什么就拉什么;胃的浊阴之气不往下降,反而往上升,就会出现腹胀。

这种脾胃升清降浊的功能失调的状态,就是中医里讲的“脾胃不和”。中医治病讲调理,那么,请问如何调和脾胃呢?

在《素问·至真要大论》中,黄帝也问了一个同样的问题:“如何把人体逆乱的气机调理正常呢?”

老师歧伯回答说:“谨察阴阳所在而调之,以平为期。正者正治,反者反治”。这句话对中医来说很重要,是中医辨证论治的准则。

脾胃升清降浊的功能失调,是一种阴阳反作、气机逆向的病证,表象与内证是呈现出一致性的,并无与内证相反的假象,当属于正者,“正者正治”,用医圣张仲景所创的“辛开苦降之法”。

香苏草一物已具备了辛开和苦降的双重特性,是天然的辛开苦降之法。且专入脾、胃经,能使脾胃的升降出入都得以平和,自然腹痛、腹胀、腹泻,饮食不化等,诸症全消。因为脾胃偏爱芳香之气,所以香苏草的第一用途在中焦脾胃。不论是寒凝、气滞,还是寒热互结在中焦脾胃,而引起的急腹症,香苏草都能有“一味单方,气死名医”的功效。

当然,过于严重的则另当别论,例如:

①寒热互结严重者,应当用“半夏泻心汤”。半夏(半升,洗),黄芩(三两),干姜(三两),人参(三两),炙甘草(三两),黄连(一两),大枣十二枚(擘)。

②寒凝严重者,应当用“理中汤”。人参(三两),干姜(三两),炙甘草(三两)、浙白术(三两)。

除上述以外,香苏草还是一味很好的外科用药。宋代医家,陈自明《外科精要》中说:“气血闻香则行,闻臭则逆。大抵疮疡,多因荣气不从,逆于肉里,郁聚为脓,得香之味,则气血流行”。

因外邪入侵,或过食肥甘厚味,化为热毒内阻,致使荣气(营气,行走在经脉)运行不畅,瘀阻于肌肉里面,血郁热聚,久则化腹,便形成了疮疡(包括痈疽,疔疮,疖肿等)这种疾病,多以红、肿、热、痛为病症特点。

如何治疗疮疡呢?重点是芳香行气。气为血帅,血为气母,气行则血行,气滞则血瘀。香苏草之气芳香可以行气化瘀,消肿止痛;味苦而性凉又可以清热解毒,所以能够治疗疮疡。中医外科治疗疮疡,秘笈是“辛凉的芳香疗法” 。

此外,跌打损伤,致青淤红肿热痛,在治疗上也几近同理。不论是疮疡,还是跌打肿痛,都可以用香苏草。内服、外敷、熏洗均可,用法不限 。

难怪住在乡野山边的乡民,顺便走出去采一把来,像从自己家的药库里取一样,自然和方便,还新鲜无敌,或用来当茶泡饮,或用来煮鸡汤喝,既可以当香料,又可以药用,真是智慧的生存之道呀。一方水土养育一方人民。也说靠山吃山,靠水吃水。这正是勤劳智慧的先民不断积累出来的生存之道,通过“第一个吃螃蟹的人”尝试,慢慢成为人们的生活经验,一代一代相传,福泽子孙。

入药部位
全草。
性味
味辛、苦,性凉。
归经
归肺、胃经。
功效
解表退热,化湿和中。
主治
感冒发热,头痛,呕吐泄泻,痢疾,烂疮,鼻衄,咳血,外伤出血。
相关配伍
1、治感冒发热,头痛呕吐:香苏草9g,姜味草3g,防风6g。水煎服。《昆明民间常用草药》

2、治消化不良,腹痛:小苏苏棵干花、叶适量。研末,拌红糖少许,每服3-6g,温开水送服。(《红河中草药》)

用法用量
内服:煎汤,9-12g。

采集加工
秋季采收,阴干。
《全国中草药汇编》:“疏风解表,利湿。主治感冒,头痛,消化不良,急性胃肠炎,痢疾。” https://t.cn/ELEP41Z


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