E252C对MIANS的可及性揭示了252位的pH依赖性构象变化-由于252和249位均位于VIII-IX环中，因此有兴趣询问E252C本身是否随pH发生构象变化，还是仅改变pHLys249对胰蛋白酶的依赖依赖性。因此，我们测试了E252C在分离的膜囊泡和纯蛋白（在DM胶束中）对各种SH试剂的可及性。为了进行控制，我们使用了也位于NhaA环中的其他单Cys替代物，但与E252C相比，它不影响NhaA的pH响应。
为了进一步探究E252C的可及性，我们接下来使用MIANS，这是一种较大且带负电荷的马来酰亚胺试剂，与NEM一样，它与硫醇基团特异性且共价反应（38，39），但仅在其马来酰亚胺时才发荧光阴离子基团与Cys（40）反应。我们首先在循环中测试了Cys替换的MIANS标记，该标记对胰蛋白酶探查的活性的pH依赖性或NhaA的构象均没有影响。MIANS与环VII–VIII中含有单个Cys残基H225C的纯化CL-NhaA的反应。
可以很容易地通过荧光法追踪4A）。pH高于6.5时，与MIANS（4 M）的反应速率随pH达到最大速率（pH 8.5）和200-300 s内的最大荧光而增加（图4A）。在pH 9下获得的结果与在pH 8.5下获得的结果非常相似，增加MIANS的浓度对最大荧光水平没有影响，表明所有Cys残基均已修饰。在环VII-VIII的K221C位和环V-VI的N177C位得到了与MIANS的非常相似的反应模式（数据未显示）。此外，在这些位置的反应的pH依赖性与与NEM的反应的pH依赖性非常相似（数据未显示）。
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