细胞无菌检测
无菌检测 sterility testing

----利用方法对细胞中细菌、真菌、支原体和病毒检验的过程。包括是否有污染及确定具体污染

一、一般要求
应根据细胞来源、潜在污染暴露史、细胞预期应用目的及所处环境等方面对细胞进行风险评估。考虑的因素包括但不限于以下几个方面:
a)应考虑细胞样本源。来自不同物种的细胞很可能携带潜在的微生物;
b) 应根据细胞的使用目的进行相关污染检测;
c)考虑细备和细胞培养的全周期所处的环境因素。根据暴露史评估可能的污染,如用于培养细胞的动物血清可能被特定的微生物污染。
依据风险评估判可能性最大的微生物污染类型,评估现有检验方法的话用性为待检测样本选择合适的方法。

二、方法选择
1.总体要求
在选择检测方法时,应了解该方法原理、微生物类型以及灵敏度等。
选择检测方法应依据预期目的、样本特性和处理因素。
选择的方法应经过验证或确认。

2.细菌和真菌
细菌是一大类普遍存在的单细胞微生物。细菌的直径通常只有几微米,其形状多样,如球状、杆状和螺旋状等。由于分布广泛、生长迅速和体积大小等特点,细菌以及酵母和霉菌是细胞培养中最常见的生物污染物。
细菌污染在培养物感染后几天内就很容易被肉眼观察到;受感染的培养物通常会变得浑浊,有时表面会有一层薄膜。经常还会出现培养基的pH值突然下降的情况。在低倍显微镜下,细菌以细小颗粒的形式出现在细胞之间,在高倍显微镜下观察可以分辨出单个细菌的形状。下面的模拟图像显示了贴壁培养的293细胞被大肠杆菌污染。
(1)依据需要选择适用干细菌和真菌的检测方法,如直接镜检法、膜过滤法、直接接种法、PCR法、MNP标记法、飞行时间质谱等。
(2)初步判断是否有细菌或真菌污染物,宜采用直接镜检法。
(3)若试验样品性质如可行,应首先选择膜过滤法进行检测。
(4)直接接种法对干细胞培养体系中添加抗生素的样品应考虑抗生素对细菌和直菌的抑制效应而影响检测的敏感性。
(5)利用PCR的方法检测细菌16SrRNA高保守区的序列来判断是否有细菌污染。利用PCR的方法检测细菌16SrRNA可变区的序列和MNP标记序列分析污染细菌的种属,利用MNPITS1或ITS2等序列判断感染真菌的种属。
(6)对微生物的组分进行检测可采用飞行时间质谱法等。

3.病毒
病毒是一种微小的感染性病原体,利用宿主细胞的结构进行繁殖。它们的体积极小, 难以在培养中被检测到,也难以从细胞培养实验室使用的试剂中去除。由于大多数 病毒对宿主有非常严格的要求,因此,它们通常不会对宿主以外物种的细胞培养物产生不良影响。但被病毒感染的细胞培养物会对实验室人员造成严重的健康威胁, 尤其是当实验室培养的是人类或灵长类的细胞时。要检测细胞培养物是否被病毒感染,可以使用电子显微镜观察、用抗体组合进行免疫染色、ELISA检测或是使用合适 的病毒引物进行PCR扩增。
(1)依据需要选择适用干病毒检测的方法,如直接镜检法、细胞形态观察及血吸附试验、体外不同细胞接种法、动物检查法、鸡胚接种检查法、PCR法、高通最测序法、基因片技术、荧光免疫法、酶联免疫法和血细胞凝集试验等方法。
(2)可利用光学显微镜观察病毒感染导致的细胞病变合胞体的形成:可通过电子显微镜观察大小和形态来识别病毒;可通过免疫电镜技术识别病毒。
(3)取细胞培养物的上清液或细胞培养物的裂解物,接种已知未污染病毒的相应细胞,检测是否出现细胞病变,或采用血细胞的吸附现象检测待检细胞培养物是否污染病毒。
(4)若采用动物检查法,可通过对普通动物或者含有特定病原体的动物,如小(包括乳鼠和成鼠)
豚鼠、仓鼠、家兔和非人灵长类动物等进行颅内、腹腔、鼻腔和皮下等部位接种,判断是否有病毒感染。
(5)分离黏液病毒、疱疹病毒和痘病毒宜采用鸡胚接种检查法。鸡胚应来自无特定病原(SPF)鸡群。
(6)采用PCR法检测病毒核酸高保守区的序列来判新是否有病毒污染。
(7)可采用高通量测序法鉴定病毒特异性序列。
(8)采用基因芯片技术检测病毒,需要合成与潜在污染的病毒基因组上的特定区域互补的核酸探针。
(9)用病毒抗原特异的抗体,通过荧光免疫反应用荧光显微镜检测细胞内病毒蛋白来判断特定的病毒污染。
(10)运用病毒抗原特异的抗体,通过酶联免疫反应检测细胞内或者上清液中的病毒蛋白来判断特定的病毒污染。
(11)通过凝集血细胞检测上清液中的病毒颗粒,如用鸡红细胞检测流感病毒。

4.支原体
支原体是无细胞壁的简单细菌,被认为是最小的自我复制生物。由于支原体非常小( 通常小于1 µm),因此很难被检测到,除非它们达到了极高的密度,导致细胞培养物变质;在此之前,通常没有明显的感染迹象。一些生长缓慢的支原体可在培养物中持续存活,而不会导致细胞死亡,但它们可以改变培养体系中宿主细胞的行为和代谢。
(1)依据需要选择适用于支原体检测的方法,如培养法、指示细胞培养DNA染色法、PCR法、荧光原位杂交法、腺苷磷酸化酶活性检测法等方法。
(2)若对支原体检测结果报告时间没有急切要求的,宜选择培养法进行检测。
(3)利用DNA热色法,经荧光显微镜下观察看到有附着在细胞表面的大小不等,不规则的荧光着色颗粒则表明存在支原体污染。
(4)通过PCR法检测支原体16SrRNA序列保守区特异性序列来判定是否存在支原体。
(5)利用带光原位杂交法检测支原体,需要设计与支原体rRNA的高度保守区域互补的蒙光探针。
(6)腺苷磷酸化酶活性检测法不适用于本身腺苷磷酸化酶活性高的细胞。

5.过程控制
样品
(1)应根据所选方法,确定足够量的供试样品。
(2)应根据供试样品可能的稳定性考虑其储存条件。
(3)应实行严格微生物规范操作,避免取样讨程中微生物污染。

试剂材料和仪器设备用具
(1)应考虑设备、试剂和耗材对微生物检测的影响。
(2)检测过程中应使用标准物质。
(3)应根据样品尺寸选择适宜的容器,避免蒸发、确保无微生物、无毒、无浸出。
(4)应配备与微生物检测能力和工作量相适应的仪器设备,其类型、测量范围和准确度应符合检测要求。
(5)检测所用试剂应贮存在适的环境中,以确保试剂的稳定性。
(6)用于微生物检测的溶液、稀释剂或冲洗剂以及所使用的耗材若是作为微生物检测测试样品的成分,则不应具有抗微生物活性的特性。

操作
(1)待测样品的收集操作应确保无污染引人。
(2)应依据微生物的最佳生长条件和营养需求选择专门的分离方法进行检测。
(3)应根据微生物的生长速度,以获得足够数量的生物体。
(4)应考虑某些微生物种类和真菌是否形成孢子。
(5)应考虑细胞培养过程中受支原体污染时,支原体可能黏附在细胞膜上仅以最低水平浓度存在于培养上清液中。
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作为芒果的S+级综艺,《乘风破浪的姐姐3》果然不负众望,开播以来始终是全网热议焦点。

宁静和那英作为师姐回归带队,两人之间的相爱相杀,是本季节目的最大看点之一,“宁那贝儿”的CP名甚至得到过节目组的认证。

除了宁静和那英外,徐梦桃、张天爱、王心凌、郑秀妍、于文文、张俪、赵樱子等姐姐也吃到了节目红利,《浪姐3》之旅不虚此行。

《浪姐》这系列节目的定位虽然是音综,但其实该节目有着非常浓厚的真人秀属性,而且很多观众更爱看这部分内容。

在这种情况下,某些言行不当的姐姐,难免会遭到观众的抵制,比如第一季的刘芸、丁当、蓝盈莹,第二季的陈小纭,以及第三季的赵樱子。

赵樱子的《浪姐3》之旅,你要说她得不偿失,但她确实得到了大量的曝光,但要说她不虚此行,似乎也不合适,因为她赢了热度却输了口碑。

赵樱子在《浪姐3》阵容中的国民度并不高,但是她总能通过自己的努力,给节目组贡献一些“不一样”的剪辑素材。

比如说自己高音仅比丁当低两度;比如初舞台表演时流泪;比如认错阿Sa和阿娇;比如把该拿花种却拿了假花,还直言自己可爱至极;比如不接受阿娇的建议,还质问对方是不是平常说话都那么直接;比如明明不合适,却疯狂自荐加入唱跳组等。

也正是因为如此,《浪姐3》无论是正片还是加更节目,但凡出现赵樱子的镜头,弹幕中都是满满的“大可不必”。

第二次公演之后,宁静组最终输给了那英组,赵樱子因为个人喜爱度排名垫底而遭遇淘汰,弹幕中更是满屏欢呼,上一次有这个“待遇”的还是陈小纭。

但是,你以为赵樱子淘汰后,“大可不必”这个充满贬义的词会消失在《浪姐3》的弹幕中吗?

答案是并没有。

更令人意外的是,“大可不必”弹幕目前集中在3人身上,而且她们都是本季《浪姐3》目前的人气王。

首先,王心凌遭遇“大可不必”,意料之外。

在《浪姐3》的首期节目中,剪辑组的重点照顾对象并不是王心凌,而是宁静、那英、于文文、徐梦桃和张天爱。

但是,王心凌凭借实力、作品和情怀,炸出了全网一大批中年男粉,上演了一出现象级翻红,音乐作品和影视作品都没能逃过被考古的命运,芒果甚至重播了《爱上查美乐》。

粉丝们疯狂示爱本没错,但却影响到了很多普通观众的观感,因为部分粉丝们不仅在有王心凌镜头时疯狂发弹幕,而且没王心凌镜头时也在不断呼吁,“王姐呢?”、“爱你”、“心凌呢”等弹幕比比皆是。

如今,王心凌得到“大可不必”这样的待遇,某种程度上来说是遭遇了爆红的反噬,甚至已经有不少人质疑现象级翻红的背后是过度营销。

但笔者认为,无论是自然发酵也好,背后有营销助力也罢,王心凌这种经历过实体唱片时代残酷竞争的实力派,值得现象级翻红,只希望粉丝们能理智一些,这样对她更好。

其次,郑秀妍遭遇“大可不必”,意料之内。

郑秀妍在《浪姐3》的表现,不可谓不突出,一公虽然不是队长,但却是《要你管》的灵魂。

二公开始担任队长直至五公,唱跳舞台《OKAY》质量很高,全员堪称是能就地成团的水平。

三公带队拿下第三名,四公带队挑战守擂的那英、容祖儿、吉克隽逸和江映蓉,而且是四个小组中唯一一个攻擂成功的小组,最终全员晋级五公总决赛。

本季《浪姐3》有一个奇怪现象,那就是唱跳舞台不是香饽饽了,姐姐们似乎都在逃避唱跳,尽管这是多方面因素造成的,但郑秀妍的存在一定是其中之一,因为要胜过她很难。

但即便是这样,在大量观众心中郑秀妍依然是不被认可的,原因无他,基本是国籍问题。

大量观众认为,《浪姐3》是国内的顶级综艺,所以这样的宝贵机会应该给到国内的艺人,而不是外籍艺人。

从郑秀妍被爆料加盟《浪姐3》,到如今第二次公演已经播完,关于郑秀妍的争议始终存在,而且很可能会持续到节目收官。

值得一提的是,在已经被爆料的五公分组中,三位队长是王心凌、谭维维和郑秀妍,而她们中哪两位能带队冲进成团夜,目前是一个很有意思的悬念,因为按照前两季《浪姐》的惯例,C位都是诞生在成团夜两位队长之间的。

最后,于文文遭遇“大可不必”待遇,其实有点冤。

于文文在《浪姐3》30位姐姐中的国民度属于不上不下,比上不如宁静、那英、王心凌、蔡卓妍、钟欣潼等,但比下是远超刘恋、赵梦、赵樱子等人的,因为她有电影《前任3》和歌曲《体面》。

如果从这个角度来看的话,于文文不该是首期节目的重点剪辑对象,但事实上她确实成为了那个人。

面对其他姐姐的初舞台面无表情、说自己不是女人从不做美甲、用“那招比较好用是吗”这样的犀利言辞制住了宁静和那英的来回踢皮球。

尽管首期节目播出后,把于文文送上热搜的是一个“拽”字,但正如宁静说的那样,于文文就是“怼人不自知”,这一点从公演开始足以证明。

更何况,从一公开始,于文文的口碑就迎来了反转,不仅自己能谈会唱,而且愿意耐心帮助没有乐器基础的张俪和王紫璇,二公时为了团队还尝试了舞蹈。

只能说,于文文如今遭遇“大可不必”,其实有点冤,大概率还是因为首期节目中的表现,很多观众已经先入为主了,既定印象难以改变。

目前遭遇“大可不必”的王心凌、郑秀妍和于文文,都是本季《浪姐3》的人气王,前两位稳居前三,于文文则稳定在第八名左右。

对于现在的这个奇怪现象,或许上图中的这个解释更加清晰明了:人越红,越有人酸。

乘风破浪的姐姐第三季


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