【我就是单纯的吐吐槽.....】
讲真开学不到两个月 每天过的跟打仗一样 累的要死还吃的贼多【就是也没瘦[摊手][摊手][摊手]】
每天不是卖电脑就是卖PCR [摊手][摊手][摊手]
不是在研究股票就是在分析regression [摊手][摊手]
不是在交作业就是在写论文 [摊手][摊手][摊手]
除了动不动开会还要每周听各个公司演讲 [摊手]
老师不仅拖堂还义务加课辅导作业[摊手][摊手][摊手]
最主要bus sim小组成员还是个智障[摊手][摊手][摊手]
好不容易reading week休息一下吧 回来就要考试 presentation 交论文[摊手][摊手][摊手][摊手][摊手][摊手]
生无可恋啊……生无可恋[二哈][二哈][二哈]
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学霸，拿起笔准备划重点啦~
一、细胞转染简介
细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。
二、实验步骤
细胞传代→细胞转染→第二次细胞传代
1、细胞传代
(1)试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。
(2)弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。
(3)用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟(37。C，5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。
(5)用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。
(6)将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。
(7)用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。
(8)将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。
(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。
2、细胞转染
(1)转染试剂的准备
A.将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
B.震荡后将试剂放在-20摄氏度保存，使用前还需震荡，。
(2)选择合适的混合比例(1：1-1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。
(3)将混合液在室温放置10—15分钟。
(4)吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
(5)加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。
(6)到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24-48小时。
3、第二次细胞传代
(1) 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。
(2) 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。
(3) 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
实验注意事项
一、筛选之前需确定G418浓度
G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%。
G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体为：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100 ug/ml~1 mg/ml 的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
二、加药时间和维持浓度
基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200 ug/ml。
考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达，一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。
三、筛选时的培养液
加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：
1. 死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液。
2. 孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。
四、单化后的鉴定
稳定转染细胞，通过PCR鉴定，发现目的基因并不上调，瞬时转染表达是增高的。
原因：瞬转是在强启动子下，稳转时你得到的细胞株可能失去了此启动子，或者是改变了细胞的生理特性!用WB和瞬转对照鉴定一下！转染后质粒整合到基因组是随机的，一般两月后（传代10代以上）还表达你想要蛋白的单可以认为是整合了质粒的。
东澳服务
服务项目
1.瞬时转染
2.稳定转染细胞株的构建
两种方法筛选：
1）转染质粒后，单克隆方法筛选稳定细胞系；
2）慢病毒感染筛选稳定细胞系。慢病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。
实验流程
1）筛选浓度测定：以10~14天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度
2）细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80%覆盖
3）细胞转染（病毒、脂质体、电穿孔、FuGENE 6、PEI等等）
4）利用质粒上含有的抗性选择进行筛选
5）鉴定筛选结果
筛选鉴定：qPCR及WB鉴定筛选结果
一、细胞转染简介
细胞转染是指将外源分子如DNA，RNA等导入真核细胞的技术。随着分子生物学和细胞生物学研究的不断发展，转染已经成为研究和控制真核细胞基因功能的常规工具。
二、实验步骤
细胞传代→细胞转染→第二次细胞传代
1、细胞传代
(1)试验准备：200ul/1mlTip头各一盒(以上物品均需高压灭菌)，酒精棉球，废液缸，试管架，微量移液器，记号笔，培养皿，离心管。
(2)弃掉培养皿中的培养基，用1ml的PBS溶液洗涤两次。
(3)用Tip头加入1mlTrypsin液，消化1分钟(37。C，5%CO2)。用手轻拍培养瓶壁，观察到细胞完全从壁上脱落下来为止。
(4)加入1ml的含血清培养基终止反应。
(5)用Tip头多次吹吸，使细胞完全分散开。
(6)将培养液装入离心管中，1000rpm离心5min。
(7)用培养液重悬细胞，细胞计数后选择0.8X106个细胞加入一个35mm培养皿。
(8)将合适体积完全培养液加入离心管中，混匀细胞后轻轻加入培养皿中，使其均匀分布。
(9)将培养皿转入CO2培养箱中培养，第二天转染。
2、细胞转染
(1)转染试剂的准备
A.将400ul去核酸酶水加入管中，震荡10秒钟，溶解脂状物。
B.震荡后将试剂放在-20摄氏度保存，使用前还需震荡，。
(2)选择合适的混合比例(1：1-1：2/脂质体体积：DNA质量)来转染细胞。在一个转染管中加入合适体积的无血清培养基。加入合适质量的MyoD或者EGFP的DNA，震荡后在加入合适体积的转染试剂，再次震荡。
(3)将混合液在室温放置10—15分钟。
(4)吸去培养板中的培养基，用PBS或者无血清培养基清洗一次。
(5)加入混合液，将细胞放回培养箱中培养一个小时。
(6)到时后，根据细胞种类决定是否移除混合液，之后加入完全培养基继续培养24-48小时。
3、第二次细胞传代
(1) 在转染后24小时，观察实验结果并记录绿色荧光蛋白表达情况。
(2) 再次进行细胞传代，按照免疫染色合适的密度0.8X105个细胞/35mm培养皿将细胞重新粉入培养皿中。
(3) 在正常条件下培养24小时后按照染色要求条件固定。
实验注意事项
一、筛选之前需确定G418浓度
G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%。
G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体为：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100 ug/ml~1 mg/ml 的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
二、加药时间和维持浓度
基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200 ug/ml。
考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达，一般是转染48小时后加入抗生素。挑出单后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。
三、筛选时的培养液
加药筛选约6天左右，细胞会大量死亡，孔中只剩下的细胞寥寥无几。这时会出现两个问题：
1. 死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液。
2. 孔中细胞数目很少，细胞之间的信号会变得很弱，也会导致阳性细胞的状态不佳甚至死亡。这个时候需要一种特殊的培养液：假如你要转染3T3细胞，在3T3细胞汇合度达到80%的时候，换液，培养过夜之后收集培养液，通过滤器消毒，和新鲜的培养液按1：1混合备用。再转染后筛选过程中就可以应用这种培养基。
四、单化后的鉴定
稳定转染细胞，通过PCR鉴定，发现目的基因并不上调，瞬时转染表达是增高的。
原因：瞬转是在强启动子下，稳转时你得到的细胞株可能失去了此启动子，或者是改变了细胞的生理特性!用WB和瞬转对照鉴定一下！转染后质粒整合到基因组是随机的，一般两月后（传代10代以上）还表达你想要蛋白的单可以认为是整合了质粒的。
东澳服务
服务项目
1.瞬时转染
2.稳定转染细胞株的构建
两种方法筛选：
1）转染质粒后，单克隆方法筛选稳定细胞系；
2）慢病毒感染筛选稳定细胞系。慢病毒感染方法较质粒转染筛选单克隆方法更方便和高效，是目前主流的稳定细胞系筛选方法。
实验流程
1）筛选浓度测定：以10~14天细胞全部死亡的抗生素浓度为筛选浓度
2）细胞接种：转染实验前天接种细胞，各种细胞的平板密度依据各种细胞的生长率和细胞形状而定。进行转染当天细胞密度应达到60%~80%覆盖
3）细胞转染（病毒、脂质体、电穿孔、FuGENE 6、PEI等等）
4）利用质粒上含有的抗性选择进行筛选
5）鉴定筛选结果
筛选鉴定：qPCR及WB鉴定筛选结果
【Microbiome：用于分析16S rRNA基因测序结果的流水线方法】 https://t.cn/R0M7mJK ① 使用通用PCR引物对原核生物特异性的16S rRNA基因的测序可研究菌群组成，标准化方案有助于可重复分析；② 短读库16S rRNA基因测序流水线（sl1p）可将预先存在的工具组合生成计算方法，自动处理原始的16S rRNA基因测序数据，转换成可读的表格和图形；③ 使用八个OTU聚类算法、两个分类方法和三个16S rRNA基因参考数据库来比较模拟群落生成的数据，④ 结果表明sl1p可通过提供全面的日志文件来促进可重复的研究，并减少用户处理测序数据的难度。
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